高通量旋转盘共聚焦

　　图1：固定Fucci4 HeLa细胞的五色成像图像。该图为使用100倍、数值孔径1.45的油浸物镜(25mm Kinetix视场)拍摄的强度叠加投影图像。实验在尼康Ti2显微镜上完成，该显微镜配备CrestOptics X-light v3转盘共聚焦扫描仪、Lumencor Celesta光源以及Teledyne Photometrics Kinetix sCMOS相机。Fucci4 HeLa细胞由Bajar等人于2016年开发。图片来源：Javier Casares，D-BSSE，ETH Zurich。

　　背景

　　Tom Lummen 博士是苏黎世联邦理工学院的显微镜工程师，他向我们谈到了他合作的成像设施，“我是运营成像核心设施的显微镜团队的一员，我们提供 20 台高端自动化显微镜来满足我们部门用户的成像需求......我们一直在为这些系统寻找新的或扩展的功能。

　　“我们有非常广泛的成像应用，这些应用范围从必须在短时间尺度内可视化的活细胞中的小亚细胞特征，一直到需要监测数周的非常大的 3D 类器官或组织培养物的开发。游戏的名称是灵活性和模块化!

　　“随着数据采集需求正朝着获取单细胞参数的方向发展，但具有非常好的统计数据和/或时间分辨率，对转盘共聚焦显微镜的需求越来越大。我们的倒转盘系统面向动态样品的活细胞观察，但我们也看到对高 3D 空间通量的需求增加。

　　挑战

　　转盘显微镜可以对活体样品进行快速成像，但这种技术可能涉及一些挑战。Lummen 博士描述了他遇到的一些挑战，“在显微镜中，在设置系统时总是需要权衡，你不可能同时拥有所有规格。我们试图追求的是专用系统，但我们试图让它们尽可能可调整。

　　“我们确定需要一个专用的倒转盘系统，该系统适用于高通量观测，无论是空间观测还是时间观测。从那时起，我们开始探索有哪些相机技术。

　　用于高速高通量活细胞成像(与旋转盘的速度配对)的合适相机需要高度灵活、具有大视场 (FOV)、小像素以实现高采样分辨率、高读出速度和高灵敏度来检测移动样品的动态。

　　Kinetix 对我们来说是一款令人兴奋的产品，因为大视野使我们能够真正提高有用的数据吞吐量，而不会影响读出速度或像素大小。——汤姆·鲁门博士

　　图2：固定小鼠脑片的四色双相机成像图像。该图为使用20倍、数值孔径0.75的空气物镜(25mm Kinetix视场)以15%的图块重叠拍摄的8×9个采集图块的最大强度投影合成图像。实验在尼康Ti2显微镜上完成，该显微镜配备CrestOptics X-light v3转盘共聚焦扫描仪、双Teledyne Photometrics Kinetix sCMOS相机以及Lumencor Celesta光源。

　　解决方案

　　Kinetix sCMOS 被确定为非常适合此类动态活细胞转盘应用的解决方案。Lummen 博士分享了他使用 Kinetix 的经验，“对活细胞动力学进行成像是 Kinetix 成为适合我们产品的主要原因之一，因为大视场让我们能够在同一时间跨度内对更多细胞进行成像，这可以按比例增加我们可以为用户提供的数据吞吐量。

　　“我们通常会根据每个实验优化我们的成像设置，并根据视场、速度、分辨率、灵敏度或其中最合适的权衡进行调整。Kinetix 提供的灵活性意味着我们不受相机限制于一两种类型的实验;原则上，它可以针对这些优化制度中的任何一个进行配置。

　　“Kinetix 的超大视场角、小像素尺寸和高速规格的结合非常诱人，我们选择它作为我们新的灵活高通量系统。它极大地提高了我们的视场角，因此我们可以在每个时间点获得更多的单元格，或者每个合成大图像获得更少的图块。与尼康 Ti2 和 CrestOptics X-Light v3 转盘共焦扫描仪的大视场相结合，我们可以配置双摄像头大视场设置。这使我们能够进一步复制数据通量或在动态样品中执行真正的并发双通道活细胞成像。此外，使用 Lumencor Celesta，这种设置可以进行近红外成像，从而增加了我们可以使用的额外光谱通道。

　　“对于多功能系统，我们经常与尼康合作，因为该软件非常模块化和开放，我们可以编写更复杂和有条件的实验脚本......通过将 Kinetix 直接连接到尼康 Ti2，我们在芯片的角落没有看到任何硬暗角，我们可以利用完整的 29 毫米视野，与我们上一代的 19 毫米 sCMOS 相比，这是一个很大的提升。高灵敏度允许以最大速度运行磁盘，有利于活细胞的荧光观察。