13价肺炎球菌结合疫苗的解吸附处理总蛋白含量测定方法的建立和优化

中文摘要

目的建立13价肺炎球菌结合疫苗解吸附处理总蛋白含量测定方法并验证。

方法13价肺炎球菌结合疫苗经解吸附处理，利用Lowry法对其总蛋白含量进行测定，对建立的方法进行线性、准确度、重复性及耐用性验证。

结果适宜的解吸附条件为加入10%体积的0.3 mol/L NaOH。在蛋白标准品40~200 μg/mL范围内，标准曲线线性良好，决定系数>0.995； 20、40、60、80、120 μg/mL的蛋白标准品回收率在95.25%~104.77%之间，方法准确度良好；样品在不同时间重复测定6次的实验结果相对标准偏差为3.82%，方法重复性良好；解吸附后室温下分别放置15和30 min，测定结果之间差异无统计学意义（t值分别为0.059和0.238，P值>0.05），且测定结果的相对标准偏差分别为4.82%和5.14%，方法耐用性良好。

结论建立的方法可有效、准确、稳定地检测13价肺炎球菌结合疫苗中总蛋白含量。

正文

肺炎链球菌属革兰阳性菌，可引起菌血症和脑膜炎等严重侵袭性肺炎球菌性疾病，在婴幼儿、老年人和潜在风险人群中有高发病率和高死亡率。肺炎链球菌最主要的毒力因子是荚膜多糖，多糖蛋白结合疫苗可以克服在婴幼儿群体中免疫原性弱的问题，能有效降低肺炎球菌性疾病的发病率。兰州生物制品研究所有限责任公司（兰州公司）研制的13价肺炎球菌结合疫苗（13‐valent pneumococcal conjugate vaccine，PCV13）可以有效预防 1、 3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F 和 23F血清型引起的肺炎球菌性疾病，对婴幼儿也可产生持久的保护力。肺炎球菌结合疫苗中的总蛋白含量是成品疫苗的重要质控指标，而其中的磷酸铝佐剂对总蛋白含量检测会造成一定干扰，需要在检测前对样品进行解吸附处理，目前有胰蛋白酶解吸附、 NaOH解吸附以及表面活性剂解吸附等方法。本研究拟采用 NaOH解吸附法对PCV13进行前处理，再利用Lowry法检测其总蛋白含量，旨在排除PCV13中铝佐剂的干扰，为准确检测总蛋白含量提供技术参考。

1

材料与方法

1.1

材料

PCV13（批号SY20211020、SY20210818、SY20210501、SY202502001）及同批次结合疫苗混合原液（各型别结合物原液按照成品比例混合配制，未添加佐剂）由兰州公司制备。

1.2

主要试剂及仪器

蛋白含量测定国家标准品（批号140619-202024）购自中国食品药品检定研究院，用水溶解并稀释配制成适宜浓度；NaOH（分析纯）、无水碳酸钠（分析纯）、酒石酸钾（分析纯）、五水硫酸铜（分析纯）、酚试剂（分析纯）均购自国药集团化学试剂有限公司； UV2450型紫外可见分光光度计购自日本岛津公司。

1.3

检测方法

取1.2 mL PCV13（批号SY202502001），加入120 μL 0.3 mol/L NaOH充分振荡混匀，即得供试品溶液。精确量取1.0 mL供试品溶液于试管中，再精确量取200 μg/mL标准品溶液0.2 、0.4 、0.6、0.8 、1.0 mL分别置于试管中，加水至1.0 mL；另取1.0 mL水于试管中作为空白对照管。每管加入1 mL碱性铜溶液，混匀，室温放置10 min，每管加入4.0 mL福林酚试液，立即混匀，室温放置30 min。于650 nm波长处测定吸光度值。参照中国药典2020年版四部通则0731 Lowry 法，以标准品溶液浓度与对应的吸光度值计算出线性回归方程，代入测得的供试品溶液的吸光度值，即得供试品蛋白含量。

PCV13中总蛋白含量=供试品蛋白含量×1.1×稀释倍数

1.4

NaOH浓度确定

分别配制0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L NaOH，按照1.3项方法预处理PCV13，以同批次结合疫苗混合原液测定值作为参考值，不同时间测定3次，计算样品回收率并确定最佳解吸附条件。

1.5

方法验证

1.5.1　标准曲线的建立及线性配制40、80、120、160、200 μg /mL标准品，按照第1.3项方法进行检测，绘制标准曲线，决定系数（R2）应≥0.995。

1.5.2　准确度验证取0.6 mL供试品溶液，分别添加0.6 mL 20、40、60、80、120 μg/mL标准品，按1.3项方法进行处理并检测。5种浓度各测定3次，同时测定未添加标准品的供试品蛋白含量，计算回收率，回收率应在95%~105%范围内。

1.5.3　重复性验证取1.2 mL PCV13（批号SY20211020），用1.3项方法进行处理并检测，不同时间重复测定6次，计算其相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），RSD应≤6%。

1.5.4　耐用性验证在其他实验参数不变的情况下，取1.2 mL PCV13（批号SY20211020），解吸附后分别室温放置15和30 min，重复测定6次，计算RSD。

1.6

统计学分析

利用统计学软件SPSS 30.0进行独立样本t检验，计算P值，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2

结果

2.1

NaOH浓度的确定

不同浓度NaOH处理的样品回收率如表1所示，0.3 mol/L NaOH对应样品回收率在98.14%~102.63%，说明此浓度下样品已完全解吸附，且相对其他浓度回收率较稳定，选择此浓度作为最佳解吸附条件。

2.2

方法的验证结果

2.2.1　线性在40～200 μg/mL标准曲线范围内，蛋白浓度与650 nm处吸光度值呈现良好的线性关系，线性回归方程为y=0.002 9x+0.005 4，R2为0.999 3。

2.2.2　准确度分别向PCV13中添加浓度为20、40、60、80、120 μg/mL的标准品，用建立的方法检测蛋白含量，回收率在95.25%~104.77%，见表2。

2.2.3　重复性PCV13（批号SY20211020）经0.3 mol/L NaOH解吸附处理后检测蛋白含量，不同时间重复测定6次，含量分别为78.47、81.95、80.63、85.39、77.76、84.53 μg/mL，RSD为3.82%，说明重复性良好。

2.2.4　耐用性PCV13（批号SY20211020）解吸附后放置15和30 min，6次检测结果的RSD值分别为4.82%和5.14%，说明改变实验条件后重复性仍良好，并分别与放置0 min的测定结果相比较，P＞0.05，差异均无统计学意义，见表3。

3

本研究中PCV13由13个型别肺炎球菌荚膜多糖分别与载体蛋白破伤风类毒素结合后，以一定比例配制并用磷酸铝佐剂吸附制成，成品中包含的蛋白有破伤风类毒素（包括结合及游离状态）及肺炎球菌荚膜多糖中含有的少量杂质蛋白；根据相关法规要求，需对其成品中总蛋白含量及吸附蛋白含量进行定量，蛋白吸附率可用于表征磷酸铝佐剂吸附蛋白的吸附程度。由于蛋白与佐剂之间的静电引力、基团交换、 范德瓦耳斯力等作用较强，结合紧密，使直接检测疫苗成品中的主要成分受到阻碍，因此在对成品总蛋白含量定量检测之前需对样品进行解吸附处理，消除佐剂对检测的干扰。

NaOH解吸附法通过改变溶液的 pH 值，使铝离子偏于中性环境，不易与蛋白通过物理作用力吸附，从而达到分离的目的。对于 PCV13， NaOH解吸附处理优于胰蛋白酶解吸附处理，本研究通过优化 NaOH浓度，最终确定加入0.3 mol/L NaOH为最优解吸附条件，此时检测蛋白回收率在98.14%~102.63%，说明在该条件下佐剂与蛋白质完全处于分离状态，蛋白质可被准确检测，解吸附成功。

标准曲线在40～200 μg/mL范围内，标准品蛋白含量检测值与吸光度值呈良好的线性关系，R2＞0.995，表明该方法线性较好；准确度验证回收率在95.25%~104.77%，说明方法准确度良好；重复性验证RSD为3.82%，说明方法重复性良好；方法耐用性结果显示，样品解吸附后放置15和30 min 的检测结果，相较于放置0 min的测定结果，差异均无统计学意义，且放置15和30 min后6次检测结果的RSD分别为4.82%和5.14%，说明改变条件后仍有良好的重复性，方法耐用性良好。

综上所述，建立的检测方法在测定兰州公司PCV13中总蛋白含量时，结果符合统计学验证的基本要求且条件简便易于实现，可有效排除PCV13中铝佐剂干扰，为准确检测PCV13中总蛋白含量提供了技术参考。

作者

刘爱萍 杜娇 李献林 周海飞 李阿妮 罗树权

兰州生物制品研究所有限责任公司第一研究室，甘肃省疫苗技术创新中心，兰州 730046

通信作者：罗树权，

Email：luoshuquan@sinopharm.com

引用本文：刘爱萍, 杜娇, 李献林, 等.13价肺炎球菌结合疫苗的解吸附处理总蛋白含量测定方法的建立和优化[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(5): 357-360.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241224-00094

识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入

生物制品微信群！

请注明：姓名+研究方向！

本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。