PNAS | 华东师范大学李超团队和北京大学雷晓光团队在植物FERONIA受体激酶的小分子抑制剂开发领域取得新进展

FERONIA（FER）属于长春花受体激酶家族CrRLK1L的核心成员之一，具有胞外区、跨膜区及细胞内激酶区的典型结构，这决定了其通过信号转导调控植物发育的重要性。近二十年研究表明，FER受体激酶在植物生长发育、抗逆及抗病中发挥重要作用。而FER对农业生产以及作物性状改良方面有待进一步深入研究。因此，开发高效的FER小分子工具，对于揭示其在精准农业中的调控机制具有重大意义。

2025年11月6日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心雷晓光团队与华东师范大学生命科学学院李超团队在PNAS上在线发表题为Unveiling FERONIA Receptor Kinase-mediated Cellular Mechanisms with Small Molecule Inhibitor的研究论文。作者通过高通量筛选及根毛表型实验，从4,378种化合物中鉴定出OTSSP167（命名Ferovicin，简称FRV）。通过结构生物学发现FRV结合于FER激酶结构域的ATP结合口袋。利用定量磷酸化蛋白质组学和FRV小分子工具，发现FRV抑制RALF1-FER-AHA2级联反应，从而诱导细胞外环境碱化，调控细胞伸长。同时，RALF1通过促使FER的Ser695位点发生磷酸化，进而激活其功能。

本研究通过解析FER激酶区与FRV小分子的共晶结构发现，FRV结合于FER激酶的ATP口袋（图1），与Lys565、Tyr610、Tyr612、Met613、Asp679等关键残基通过氢键和π-π堆积作用稳定结合。FRV解离常数（0.4 μM）远低于对照ATP (18.37 μM），表明FRV是一种高效的ATP竞争性抑制剂。ADP-Glo激酶活性检测实验显示，FRV对FER的IC50值为70 nM，活性优于之前发现的其他抑制剂。进一步获取了关键结合位点的点突变体包括K565A、Y610A、Y612A、M613A和D679A的，验证了FRV和FER的分子结合机制。体外酶活实验表明K565A、Y610A和D679A突变显著削弱FRV抑制效果（IC50> 100 μM），且Y612A和M613A突变也会降低激酶基础活性。表面等离子共振实验显示Y612A突变导致FRV结合亲和力降低超1000倍，凸显该残基在抑制剂识别中的关键作用。以上结果共同证实FER的ATP结合口袋中五个关键残基对FRV高效抑制FER激酶功能具有重要作用。

图1. 共晶结构揭示FRV占据FER激酶ATP结合口袋

通过激酶活性（图2A）和表面等离子体实验（图2B-F）评估FRV的选择性，结果显示其对FER激酶具有高度特异性，结合亲和力显著高于TMK4、BRI1等其它重要植物激酶，选择性差异达数十倍。结构分析与分子对接表明，FRV与FER结合口袋中关键残基（K565、Y610等）形成的疏水作用及氢键网络是其选择性的结构基础，且结合构象更为稳定。此外，关键残基在苔藓和多种代表性被子植物中高度保守，揭示FRV具备广谱抑制多物种中FER激酶的潜力。

图2. 酶活与结合亲和力分析揭示FRV对FER激酶的抑制机制

通过磷酸化蛋白质组学方法，发现RALF1小肽诱导了FER关键位点S695的磷酸化，而FRV处理抑制该位点的磷酸化（图3A）。进一步通过组间的差异比较发现，FRV通过阻断FER–RALF1的磷酸化，干扰了其下游信号通路。RALF1/CK和RALF1/(FRV+RALF1)之间有345个共同上调和364个共同下调的磷酸化蛋白（图3B）。对这些共同蛋白进行GO分析，结果显示主要富集于细胞生长、分裂、极性建成、细胞骨架组织等生物学过程（图3C）。

图3. 磷酸化组学发现FRV影响RALF1–FER信号通路

组学分析中发现在RALF1–FER介导的磷酸化蛋白中，质子泵AHA1/2的 S899位点磷酸化水平显著上调（图4B）。通过进一步检测主根表皮分生区细胞的伸长情况，发现FRV能够抑制RALF1–FER调控的细胞伸长过程（图4A）。通过检测细胞长度和胞外pH水平，发现AHA2S899D转基因株系对RALF1呈现不敏感，而FRV可有效抑制RALF1效果（图4C, D）。通过构建多种组合的单点突和多点突变体转基因材料，发现FRV抑制FER的活性主要是通过影响其中两个关键位点Y610和K565，而Y612、M613和D679的影响相对较小（图4E）。

图4. RALF1–FER通过AHA1/2S899介导的胞外碱化作用调控细胞伸长

磷酸化蛋白组学还揭示了FRV抑制RALF1诱导的FER S695位点的磷酸化，而利用广谱磷酸化抗体检测，结果显示FRV处理有效抑制了RALF1诱导的FER磷酸化（图5A）。同时，采用制备的FER S695/T696磷酸化特异性抗体进行检测，发现RALF1处理显著促进野生型中FER的磷酸化水平升高（图5B）。通过检测细胞长度和胞外pH水平，发现FERS695A突变体对RALF1处理不敏感（图5C, D）。以上结果表明通过FRV的处理和分析，有效地找出了S695是FER感受RALF1小肽而激活的关键位点，其对于调控细胞伸长具有重要作用。

图5. RALF1通过激活FER-S695A磷酸化调控细胞伸长

综上所述，本研究筛选出高效选择性的FER激酶小分子抑制剂FRV，通过共晶结构解析等发现其特异性结合于FER激酶区的ATP口袋，从而抑制FER激酶活性。利用小分子工具FRV并结合磷酸化蛋白质组学技术，我们发现RALF1信号处理引起的关键磷酸化位点S695位点激活FER、引发下游AHA1/2质子泵S899位点的磷酸化，从而调控主根表皮分生区细胞生长。本研究阐明了FRV小分子化合物是FER有效的激酶抑制剂，该抑制剂对于解析FER受体激酶参与的生物学过程的研究和信号机制的解析具有重要辅助作用，并有望成为农作物远缘杂交育种和免疫调控的重要工具。

华东师范大学生命科学学院李超教授和北京大学雷晓光教授为共同通讯作者，北京大学博士后孙萌泽和华东师范大学博士后逯佰艳为共同第一作者，上海师范大学戴绍军教授和任巍巍博士参与了该项研究。该工作得到了国家自然科学基金杰出青年基金和重点项目、国家重点研发计划、上海市科学技术委员会项目、The National Science Foundation of the US、北京分子科学国家研究中心、北大-清华生命科学联合中心和博士后面上项目等的支持。

论文链接：

https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2515322122