细胞房微生物污染全流程管控指南：预防、判断与处理

一、核心前提：微生物污染的预防措施（源头阻断 + 过程管控）

预防是细胞房污染管控的核心，需构建 “源头 - 操作 - 环境” 三维防控体系，从根本上降低污染风险。

1. 源头输入管控

• 试剂与耗材无菌化：培养基、血清、胰酶等需经 0.22μm 滤膜过滤除菌，分装后标注批次与日期，4℃/-20℃密封储存，避免反复冻融；无菌耗材（培养瓶、移液管等）需选用合格厂家产品，检查包装无破损、灭菌标识完整，高压灭菌后的耗材需抽样验证无菌性（空耗材无菌水冲洗后培养 48h）。

• 细胞引入筛查：新购细胞系必须通过 PCR 法（支原体）、无菌培养法（细菌 / 真菌）检测，合格后再扩增培养；冻存细胞复苏前，用 75% 乙醇擦拭冻存管外壁，复苏操作全程在生物安全柜内进行。

• 人员准入管理：仅经无菌操作培训并考核合格的人员可进入细胞房，外来人员禁止入内；进入时需更换无菌服、口罩、手套、发套，头发、衣物完全遮盖，操作前用 75% 乙醇消毒双手。

2. 操作过程规范

• 无菌操作准则：所有开盖、移液、传代、换液操作必须在生物安全柜内进行，开机运行 15 分钟待气流稳定后再开始；瓶口开盖后倾斜放置（避免垂直暴露于气流），暴露时间不超过 30 秒，操作时禁止交谈、咳嗽或触摸非无菌物品。

• 分区与专用管理：不同细胞系在生物安全柜内分区操作（贴标识区分），专用移液管、废液缸、培养器具，严禁混用；实验后立即用 75% 乙醇擦拭安全柜台面，废液密封后倒入专用收集桶，污染耗材单独存放并标注 “污染” 标识。

• 操作细节把控：移液时动作轻柔，避免液体飞溅；培养基添加抗生素时需控制浓度（避免过度依赖导致耐药性），长期培养细胞建议定期无抗生素培养，便于及时发现污染。

3. 环境与设备保障

• 日常消杀流程：细胞房每日实验前后各开启紫外灯消毒 30 分钟（消毒后通风 30 分钟再进入）；地面、台面、门把手、设备表面每日用 75% 乙醇擦拭，每周用含氯消毒剂（如 5% 次氯酸钠）彻底清洁一次；实验垃圾当日清理，密封后高压灭菌处理。

• 设备定期维护：生物安全柜每年至少校准 1 次，检测 HEPA 过滤器是否泄漏、风速是否达标（0.38-0.51m/s）；培养箱每周清理内部积水、用 75% 乙醇擦拭内壁，每月更换无菌水托盘，CO2 传感器定期校准；冰箱、离心机每月用 75% 乙醇消毒内壁，避免残留污染。

• 环境参数管控：保持细胞房正压通风、恒温恒湿（温度 25±2℃，湿度 50±10%），避免潮湿环境滋生霉菌；定期更换通风系统滤网，确保空气净化效果。

4. 定期监测强化

• 常规污染监测：每周对细胞房空气、生物安全柜、培养箱进行沉降菌检测（37℃培养 48h，菌落数≤3 个 / 皿为合格）；在养细胞每 1-2 个月用 PCR 试剂盒筛查支原体，每季度抽检细菌、真菌污染情况。

• 制度落地执行：制定《细胞房无菌操作 SOP》《耗材试剂管理规范》，全员培训并定期考核；建立试剂耗材使用台账，记录灭菌日期、批次，避免使用过期物品；新人上岗需专人带教，确保操作规范。

二、关键判断：如何识别细胞房微生物污染？

污染判断需结合 “细胞状态观察 + 实验室检测”，及时发现早期污染迹象，避免扩散。

1. 肉眼与显微镜观察（快速初步判断）

• 细菌污染：培养液在 24-48h 内快速浑浊（呈乳白色或黄色），pH 值急剧下降（培养液变黄）；显微镜下（100× 或 200×）可见大量微小颗粒状细菌，分布于细胞间隙或培养液中，细胞会逐渐出现贴壁不良、形态异常（皱缩、脱落）。

• 真菌污染：培养液浑浊速度较慢（3-7 天），后期可见白色、绿色或黑色菌丝（漂浮于液面或附着在培养瓶壁）；显微镜下可见真菌孢子或丝状结构，细胞生长缓慢，最终因营养争夺或毒素作用死亡。

• 支原体污染：培养液无明显浑浊，pH 值变化不大，易被忽视；显微镜下（400×）可见细胞表面或间隙有微小颗粒（支原体直径 0.2-0.3μm），细胞表现为生长缓慢、形态不规则（胞质出现颗粒、边缘模糊），传代后活力持续下降。

• 其他污染：若出现多种微生物混合污染，培养液会快速浑浊并伴随异味，细胞短时间内大量死亡。

2. 实验室专项检测（精准确认）

• 无菌培养检测：取疑似污染的细胞上清或试剂，接种到无血清培养基（检测细胞相关污染）或 LB 培养基（检测细菌）、沙堡培养基（检测真菌），37℃培养 48-72h，观察是否出现菌落或浑浊。

• 支原体专项检测：采用 PCR 法（灵敏度高，2-3h 出结果）或荧光染色法（直接观察支原体 DNA），检测细胞上清或细胞裂解液，阳性结果可确诊支原体污染。

• 环境采样检测：若怀疑环境或设备污染，对细胞房空气、台面、培养箱内壁进行涂抹采样，接种培养后观察菌落生长，判断是否为环境源性污染。

三、应急处置：微生物污染的处理方法

污染处理需遵循 “快速隔离、彻底消杀、追溯源头、预防复发” 原则，避免污染扩散至其他细胞或环境。

1. 紧急隔离：阻断污染扩散

• 立即停止污染区域所有实验操作，将污染细胞培养瓶 / 皿密封，标注 “污染 + 日期” 标识，单独存放于隔离区域（避免与正常细胞、耗材接触）。

• 操作人员更换手套、无菌服，用 75% 乙醇彻底消毒双手及接触过的设备表面（如安全柜把手、实验台），禁止将污染样本的耗材（如移液管）用于正常细胞操作。

• 若为多细胞系污染，立即将所有正常细胞转移至备用培养箱，密封保护，避免交叉污染。

2. 针对性消杀：清洁污染区域

• 生物安全柜消杀：关闭安全柜风机，用 75% 乙醇喷洒台面、内壁及出风口，静置 10 分钟后用无菌纱布擦拭；若污染严重（如细菌大量滋生），先用 5% 次氯酸钠溶液擦拭，作用 30 分钟后用无菌水冲洗，再用乙醇二次清洁，最后开机运行 30 分钟通风。

• 培养箱消杀：取出所有细胞样本，清空培养箱，用 75% 乙醇擦拭内壁、托盘及隔板，放置含氯消毒棉片密封 30 分钟；倒空无菌水托盘，用消毒剂清洗后晾干，重新加入新鲜无菌水，开启 CO2 循环运行 2 小时，经沉降菌检测合格后方可使用。

• 细胞房环境消杀：关闭细胞房人员进出，开启紫外灯全面消毒 60 分钟，消毒后通风 30 分钟；用含氯消毒剂擦拭地面、墙面、门把手及所有设备表面，重点清洁污染区域周边，必要时用气溶胶消毒剂进行空间消毒。

3. 源头追溯：避免污染复发

• 排查同批次试剂（培养基、血清、胰酶等），通过无菌培养检测是否存在试剂污染，疑似污染试剂立即全部丢弃，更换新批次并验证无菌性。

• 回顾操作流程，排查是否存在违规操作（如安全柜外开盖、耗材混用），新人操作是否存在不规范行为，针对性强化培训。

• 检查设备状态：生物安全柜 HEPA 过滤器是否泄漏、风速是否达标；培养箱门封条是否老化、是否积水；紫外灯强度是否≥70μW/cm²（不足则更换），确保设备正常运行。

• 若为支原体污染，需对所有在养细胞进行支原体筛查，丢弃阳性细胞，并用支原体专用消毒剂消杀培养箱、安全柜，后续培养基中可短期添加支原体抑制剂（如支原体清除剂）。

4. 后续恢复与预防强化

• 消杀完成后，对细胞房环境、设备进行无菌监测（沉降菌培养、表面涂抹采样），所有指标合格后方可恢复实验。

• 丢弃所有确认污染的细胞、试剂及接触过的耗材，不得二次使用；若污染细胞为关键细胞系，可尝试用抗生素挽救（如细菌污染用青霉素 + 链霉素，真菌污染用两性霉素 B），但挽救后需连续 3 代检测无菌性，确认无残留污染。

• 组织操作人员复盘污染事件，优化防控措施（如增加高风险试剂的检测频率、强化新人培训），更新《细胞房污染应急处理 SOP》，避免同类污染再次发生。

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