神经环路应用（26）丨组织透明化技术应用及案例解析

组织透明化技术是一种革命性的生物样本处理方法，通过化学手段去除组织中的脂质、色素等导致光散射和吸收的关键成分，并使用高折射率的透明介质替换，从而显著降低组织对光的散射，使其变得透明。这一过程使得厚组织样本（如完整器官甚至小鼠全脑）在保持原有三维结构和分子信息（如蛋白质、核酸）完整性的前提下，能够被高分辨率的光学显微镜（如共聚焦、双光子或光片显微镜）进行深层、快速的三维成像。

以EZ Clear 技术为例解析

Fig1 利用EZ Clear进行成年小鼠组织光学透明化的水相清除方案

通过EZ Clear 技术以水性溶液为基础，经灌注固定、脂质去除、折射率匹配等步骤，降低组织光学散射，使组织达到光学透明状态，同时保留外源荧光染料（如荧光标记番茄凝集素）和内源荧光报告基因（如 Thy1::GFP）的信号，适用于成年小鼠多种软组织的光片荧光显微镜成像。

1.灌注与组织获取：

（1）眶后注射荧光标记试剂

胰岛素注射器吸取 50μL DyLight 649 标记番茄凝集素（或 2% 伊文思蓝溶液）；小鼠放入 1L 麻醉诱导箱，通入 1-2L/min 氧气，异氟烷浓度从 0.5% 梯度升至 4%，待小鼠失去翻正反射、呼吸变深慢后，转移至鼻锥（异氟烷浓度 2%-3% 维持麻醉）；3 分钟后检测趾捏反射，确认麻醉深度；小鼠侧卧，非优势手拇指和中指固定身体（避免按压颈部/气管），眼部涂润滑剂；非优势手食指和拇指拉开眼眶周围皮肤，使眼球微凸，45° 角插入针头，轻拉柱塞吸出血液（确认位置正确），注射 50μL 试剂，3-5 秒后拔针，检查注射部位无肿胀/损伤；小鼠放回清洁笼，监测至苏醒，试剂循环 5 分钟后进入下一步。

（2）经心脏灌注

麻醉小鼠仰卧固定，70%乙醇消毒胸部。剪开胸腹腔暴露心脏，27G针头插入左心室，缓慢注射100 μL同型荧光试剂，留针1分钟。剪开右心耳放血，连接注射泵，以4 mL/min速度依次灌注10 mL PBS（去血）和10 mL 4% PFA（固定），见肝脏变浅、尾卷曲即为成功。

解剖获取目标组织（如脑、眼、心脏），冰浴 1X PBS 冲洗残留血液，落射荧光显微镜确认组织标记均匀。

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2. 后固定与清洗

组织放入玻璃闪烁瓶，加入 4% PFA（20:1 固定剂 - 组织体积比），4℃避光固定（成年小鼠脑 24 小时，眼 1 小时）；固定后，1X PBS 室温清洗 3 次（每次 30 分钟，共 90 分钟），Belly dancer 摇床轻柔摇晃（档位 4）；清洗后，组织转移至含 0.05% 叠氮化钠的 1X PBS 中，4℃避光储存（可暂停，长期保存需避免反复冻融）。

3. 脂质去除

弃去储存液，组织放入玻璃闪烁瓶，加入 50% THF 溶液（完全浸没组织），铝箔包裹避光；通风橱内，Belly dancer 摇床室温孵育 20 小时（2 月龄小鼠多数组织）；若为 5 月龄小鼠肝、肾、心脏、脾，需延长至 68 小时（20 小时后，依次用 70%、80%、100% THF 各孵育 12 小时）；弃去 THF 溶液（倒入化学废物桶），Milli-Q ddH₂O 室温清洗 4 次（每次 1 小时，共 4 小时）；清洗后，通风橱内敞口放置 10 分钟，去除残留 THF；组织可转移至含 0.05% 叠氮化钠的 1X PBS 中，4℃储存（可暂停）。

4. 折射率匹配（透明化）

弃去储存液，组织放入 50mL 离心管，加入 20mL EZ View 溶液（完全浸没），铝箔包裹避光；

20-25℃轻柔摇晃（摇床档位 4），1-2 天后观察组织透明度（放置于网格纸上，可清晰看到下方网格线为透明成功）；

期间用折光仪检测 EZ View 溶液 RI，若低于 1.49，更换新鲜溶液；透明后可 4℃储存（有效期 1 个月，避光）。

5. 琼脂糖包埋与成像前平衡

（1）琼脂糖包埋

5mL 注射器切去针头端（边缘磨平，避免损伤组织），直立固定于离心管架，加入 3mL 42℃ 1% 琼脂糖；待琼脂糖表面开始凝固（约 2-3 分钟），放入透明化组织（如脑：小脑朝柱塞，嗅球朝开口），调整位置至中心，补加琼脂糖至完全浸没；

4℃冷藏 15 分钟或室温放置 1 小时，待琼脂糖完全凝固；推动柱塞，推出琼脂糖-组织复合物，razor blade 修剪多余琼脂糖（仅保留组织周围 1-2mm 琼脂糖，减少激光散射）。

（2）成像前平衡

包埋样本放入 50mL 离心管，加入 20-25mL EZ View 溶液，铝箔包裹，parafilm 密封管口（防蒸发）；

20-25℃轻柔摇晃，3 小时-1天后观察琼脂糖透明，即可用于光片荧光显微镜成像。

总结：

EZ Clear 技术作为一种简单、快速且稳健的成年小鼠组织透明化方法，凭借其流程简化（三步核心操作）、耗时短（48 小时内完成）、荧光信号保留好、兼容性强等优势，在生物医学研究多个领域具有广泛应用，该技术可清晰呈现成年小鼠脑部神经元及神经连接的三维结构，为神经环路解析提供关键支持。

文献引用：

• https://doi.org/10.1016/j.xpro.2024.103053

• Cai, R., Kolabas, Z.I., Pan, C. et al. Whole-mouse clearing and imaging at the cellular level with vDISCO. Nat Protoc 18, 1197–1242 (2023). https://doi.org/10.1038/s41596-022-00788-2

• Saria, A., andLundberg,J.M.(1983).Evansblue f luorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J. Neurosci. Methods 8, 41–49. https:// doi.org/10.1016/0165-0270(83)90050-X.

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