神经环路应用（24）丨逆行跨多突触示踪技术

逆行跨多突触示踪技术利用具有逆向跨突触传播能力的病毒（如狂犬病毒、伪狂犬病毒），从特定起始神经元出发，逐级逆向标记其上游多级输入神经元，用于解析神经环路的多级上游输入结构。通过突触逆向传递，依次感染直接输入（一级）、间接输入（二级、三级等）的上游神经元，实现多突触回溯。

基于复制缺陷型伪狂犬病毒（PRV^ΔIE） 与AAV 辅助载体构建的逆行跨多突触示踪技术，核心是通过AAV介导IEo诱导表达→PRV^ΔIE 复制与跨突触扩散→时间/空间调控示踪路径，实现定向、逐步示踪。

Fig1 基于复制缺陷型伪狂犬病毒（PRV^ΔIE）和辅助腺相关病毒（Helper AAVs）的神经环路示踪策略

首先，在起始区域（Starter region）注射复制缺陷型PRV^ΔIE，该病毒因自身缺陷，无法自主复制和跨突触扩散。

接着，在中间区域1（Intermediate region-1）和中间区域2（Intermediate region -2）注射辅助AAVs。这些辅助AAVs能提供PRV^ΔIE复制所需的关键因子（如IE180基因等），使PRV^ΔIE在这些中间区域能够进行复制。

随着PRV^ΔIE在中间区域的复制，它可以跨突触扩散，逐步追踪神经环路，最终到达并标记最终示踪区域（Final traced region），从而实现对从起始区域到最终示踪区域的多突触神经环路的定向、逐步示踪。

脑声常谈建立了多个《动物模型构建与行为评估》交流群，群内分享各种经典和前沿的行为范式，共同交流解决动物实验中遇到的棘手问题，避坑少走弯路！有需要的老师可以扫码添加微信进入讨论群！

核心病毒载体构建

（1）复制缺陷型伪狂犬病毒（PRV^ΔIE）构建

基因改造：敲除伪狂犬病毒（PRV）的即早基因 IE180（双拷贝），生成 PRV^ΔIE（无法自主复制和跨突触扩散）；根据示踪需求，在 PRV^ΔIE 基因组中插入报告基因（如 EGFP 或 Cre 重组酶），分别构建 PRV^ΔIE-EGFP（体外检测）和 PRV^ΔIE-Cre（体内示踪，需结合报告小鼠）。

体内示踪简要步骤（以Ai9 报告小鼠为例）

Fig2 病毒注射区域

实验动物准备：

选择 6-15 周龄 Ai9 小鼠（Cre诱导表达tdTomato），随机分组，单笼饲养，12h 光暗周期，自由摄食饮水。

多西环素调控（时间控制病毒复制，降低毒性）

调控方案：

基础状态：小鼠全程饮用含 200μg/mL Dox+1% 蔗糖的饮水（或喂食含Dox 的饲料），抑制 IEo 表达；

激活窗口：在 PRV^ΔIE 注射前 48h 至注射后 24h，停用 Dox 饮水，改为普通蔗糖水，允许IEo表达以激活 PRV^ΔIE 复制；

恢复抑制：PRV^ΔIE 注射 24h 后，重新给予Dox饮水，终止病毒复制。

在伏隔核（NAc） 注射 PRVΔIE-Cre（复制缺陷型伪狂犬病毒，用于跨突触示踪）；在中间脑区（Intermediate area） 注射辅助AAV（AAV - rtTA、AAV - TRE - IEo，为PRVΔIE提供复制所需的关键因子，使病毒能跨突触扩散）；最终目标是追踪海马与NAc之间的神经环路。

应用场景

• 逆行跨多突触技术可用于评估神经精神疾病（如精神分裂症、抑郁症、成瘾等）中异常的神经环路连接；

• 评估治疗效果和药物作用机制；

• 评估损伤后神经环路的重塑：在神经系统损伤（如脑损伤、脊髓损伤等）后，逆行跨多突触技术可以追踪损伤区域周围神经元与上游脑区之间突触连接的重塑过程，了解神经再生的发生机制和影响因素，为开发促进神经再生和功能恢复的治疗策略提供依据。

文献引用：

• Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus Du, Wenqin et al.Cell Reports Methods, Volume 3, Issue 6, 100506
  

• Qiu L, Zhang B, Gao Z. Lighting Up Neural Circuits by Viral Tracing. Neurosci Bull. 2022 Nov;38(11):1383-1396. doi: 10.1007/s12264-022-00860-7. Epub 2022 May 16. PMID: 35578093; PMCID: PMC9672192.

脑声小店基于深度科研洞察，专注为动物实验提供"简器械·精实验"解决方案。我们突破高精设备局限，开发手工定制化仪器及配件，通过科研巧思将基础工具转化为创新实验方案。产品涵盖行为学装置、操作辅助工具等，使实验室在保持操作简效的同时，实现精细化数据采集，助力科研人员以创造性思维发掘简易仪器的潜在科研价值。