Nat Commun | 胡昉昊/吝易开发基于受激拉曼散射的蛋白质相分离和聚集的原位二级结构成像技术

生物大分子通过低复杂度结构域（LCD）相互作用和液-液相分离（LLPS）可以形成类似液体的凝聚体。相分离凝聚体能够以高时空选择性调控细胞内各种生理活动，其中蛋白质凝聚体（protein condensates）在调节蛋白质功能中发挥着重要作用，并且其向蛋白质聚集体（protein aggregates）的转变被认为与退行性疾病高度相关。然而，直接成像观测相分离凝聚体中蛋白质结构的方法仍少有报道。

近日，清华大学化学系胡昉昊课题组与生命科学学院吝易课题组合作在Nature Communications期刊上发表了文章In situ secondary structure imaging of protein phase separation and aggregation by hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy，开发了基于高光谱受激拉曼散射（SRS）的蛋白质二级结构无标记定量成像技术，通过对蛋白质凝聚体的原位结构成像，揭示了相分离蛋白质中二级结构由无序向有序的转变，并在单个凝聚体水平观测相分离蛋白的老化过程、疾病相关突变以及活细胞内蛋白质聚集体的二级结构异质性，为研究蛋白质相分离以及病理聚集过程提供了重要的分子结构和空间信息。

蛋白质酰胺骨架的振动信号对二级结构十分敏感。作者通过对蛋白质酰胺I带拉曼光谱的分析，获得了蛋白质四种二级结构（a-helix, b-sheet, extended structure and random coil）的特征拉曼峰，并结合光谱线性拆分开发了针对蛋白质二级结构的高光谱SRS成像技术。该技术能够高准确性的实现四种二级结构的无标记定量光学成像，并在多种蛋白中验证其二级结构组成与文献值一致。

作者首先将蛋白质二级结构原位成像技术应用于研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）相关蛋白的相分离过程，揭示了相分离凝聚体中蛋白质有序二级结构的增加，并伴随着凝聚体中水含量的显著降低。通过对单个蛋白质凝聚体的追踪成像，进一步观测到FUS LCD蛋白在老化过程的液-固转变和二级结构变化。特别是富含β-sheet的区域首先出现在液态的凝聚体表面，并随时间生长为接近固态的蛋白质聚集体。作者还研究了蛋白质二级结构与氨基酸突变和相分离性质的关系，发现了脯氨酸促进无序结构生成和增加凝聚体流动性，而谷氨酰胺促进有序二级结构的生成。因此该技术既可获得二级结构的定量变化，也可实现高分辨成像以研究蛋白质结构的空间异质性，展示其在蛋白质相分离研究中的巨大潜力。

最后，作者将原位二级结构SRS成像技术用于研究活细胞内亨廷顿蛋白突变体Htt-Q74聚集。作者发现EGFP标记显著影响Htt-Q74蛋白的聚集，无EGFP标记的Htt-Q74在细胞内形成更加紧密的聚集体，并且具有异质的结构和亚细胞分布。其中一类Htt-Q74聚集体在细胞质中被脂质包裹，并具有独特的核-壳结构，其内核富含β-sheet结构，而外壳具有较多的α-helix。同时作者也观察到在细胞质和细胞核内另外两种富含α-helix结构的Htt-Q74聚集体。这可能反映不同阶段的Htt蛋白聚集过程，展现了无标记二级结构SRS成像技术在研究生命体系中蛋白质折叠与聚集的重要作用。

综上，该研究开发了基于高光谱SRS的蛋白质二级结构定量成像技术，实现了蛋白质凝聚体的原位二级结构成像，揭示了相分离蛋白有序结构的增加，展现了凝聚体老化过程中结构变化的界面异质性，并研究了氨基酸突变与蛋白质结构和相分离性质的关系，最终实现了活细胞内蛋白质聚集体的无标记结构成像。这一技术的开发为原位研究相分离等复杂体系中蛋白质二级结构的变化和空间异质性提供了新的成像方法。

清华大学化学系博士生孙瑞峰为该工作第一作者，化学系胡昉昊副教授和生命科学学院吝易副教授为文章的共同通讯作者。

https://www.nature.com/articles/s41467-025-63894-1

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