华南理工大学熊梦华教授JACS：新型抗菌多肽，显著提升抗菌选择性

新型螺旋可变形抗菌多肽

随着多重耐药菌的日益增多，抗菌肽（AMPs）因其独特的膜破坏机制和不易产生耐药性而备受关注。然而，AMPs的α-螺旋结构在增强其杀菌能力的同时，也容易穿透哺乳动物细胞膜，导致线粒体损伤和细胞毒性，这一副作用严重限制了其临床应用。如何在不牺牲抗菌活性的前提下降低对宿主细胞的毒性，成为当前AMP研究领域的一大挑战。

近日，华南理工大学熊梦华教授、武汉工程大学蔡璐副教授合作开发出一种细菌磷脂诱导的螺旋可变形抗菌多肽（HT-AMP），命名为C6–10。该多肽在初始状态下具有适中的螺旋度（38%），能有效减少对哺乳动物细胞的穿透和线粒体损伤；而在识别细菌膜中富含的磷脂酰甘油（PG）后，其螺旋度显著提升至约77%，从而发挥强大的抗菌作用。这一“PG触发螺旋转变”策略显著提高了抗菌选择性，为设计高选择性抗菌药物提供了新思路。相关论文以“Bacterial Phospholipid-Inducible Helix-Transformable Antimicrobial Polypeptides”为题，发表在

JACS

研究团队设计并合成了一系列侧链电荷与主链距离不同的多肽（C6–9、C6–10、C6–11），通过调控静电排斥力实现对其螺旋度的精确控制。随着电荷与主链之间σ键数从11减少至9，多肽的螺旋度依次从76%降至38%和20%。其中，C6–10在初始状态下螺旋度适中，而在与PG脂质体作用后，螺旋度迅速上升至77%，表现出显著的螺旋可变形特性。相比之下，在模拟哺乳动物细胞膜的脂质体环境中，其螺旋度提升有限，显示出对细菌磷脂的高选择性响应。

示意图1：通过精细调控RAPs的螺旋度以在初始状态下保持适中螺旋度，并在识别PG后增强螺旋度，从而有效提升抗菌选择性。 （A）具有不同螺旋度的多肽化学结构。随着侧链阳离子基团与多肽主链之间的距离从11个σ键缩短至9个σ键，多肽的螺旋度因侧链电荷排斥增强而逐渐降低。 （B）螺旋可变形抗菌多肽（HT-AMP）增强抗菌选择性的示意图。HT-AMP在初始状态下具有适中螺旋度，膜穿透能力有限，对线粒体损伤小；在与PG相互作用后，其螺旋度显著增加，从而强力破坏细菌膜。

进一步的分子动力学模拟表明，C6–10在细菌膜模拟环境中能迅速形成稳定的α-螺旋结构，而在哺乳动物膜模拟环境中则保持较低螺旋度。等温滴定量热实验证实，C6–10与PG的结合力强于与哺乳动物磷脂PS的结合，且能诱导PG脂质体形成层状聚集结构，并引发明显的染料泄漏，表明其能有效破坏细菌膜完整性。这些结果从结构和功能层面验证了C6–10的螺旋可变形机制及其选择性膜破坏能力。

图1：细菌磷脂诱导的螺旋可变形抗菌多肽的构建与表征。 （A）具有不同侧链阳离子基团与主链距离的多肽的圆二色谱图。 （B）多肽的螺旋度。 （C）POPG脂质体与（D）模拟哺乳动物细胞膜的脂质体（含15% POPS）对多肽螺旋度的影响。 （E）在水溶液中、（F）在模拟哺乳动物细胞膜的脂质双层表面、以及（G）在模拟细菌细胞膜的脂质双层表面，C6–10二级结构形成的MD模拟时间进程。不同颜色代表不同二级结构。 （H）ITC测定的多肽与POPG相互作用释放的积分热量。 （I）多肽与SUVsPOPG或SUVsPOPS相互作用的结合常数。 （J）滴定多肽时SUVsPOPG粒径的变化。 （K）C6–10/SUVsPOPG聚集体的SAXS图谱。图中展示了0 ns和50 ns时的构象图像。

在抗菌性能方面，C6–10在保持与高螺旋多肽C6–11相当的抑菌活性的同时，对哺乳动物细胞（如NIH 3T3和RAW 264.7）的毒性显著降低，表现出更高的抗菌选择性指数。在与红细胞和大肠杆菌共培养的模型中，C6–10能选择性杀灭细菌而不引起明显溶血。此外，C6–10对多种标准菌株及临床耐药菌（如耐碳青霉烯大肠杆菌、MRSA等）均表现出广谱杀菌活性，且在连续传代实验中未诱发耐药性。

图2：具有适中螺旋度的C6–10表现出更优的抗菌选择性。 （A）对NIH 3T3细胞的半最大抑制浓度（IC₅₀）； （B）对大肠杆菌的最小抑制浓度（MIC）； （C）多肽的抗菌选择性指数（IC₅₀/MIC）； （D）多肽在细菌与红细胞共培养系统中选择性杀灭细菌的示意图及抗菌选择性（定义为杀菌率与溶血率之比）； （E）评估磷脂对C6–10抗菌活性影响的实验流程示意图； （F）C6–10与不同摩尔比POPG预孵育后的显色图像； （G）通过刃天青蓝法检测的C6–10 MIC值； （H）C6–10处理后的细菌死活染色与SEM图像； （I）PI阳性细菌比率； （J）C6–10对多种标准菌株及（K）临床耐药菌的杀菌率。

为探究螺旋度对细胞摄取与细胞器损伤的影响，研究人员比较了不同螺旋度多肽在细胞内的积累情况。结果显示，高螺旋的C6–11在细胞内积累显著，并引发线粒体膜电位丧失和结构损伤；而C6–10与低螺旋的C6–9则几乎不进入细胞，也不引起线粒体功能障碍。此外，通过延长C端烷基链（如C8–10、C10–10）进一步提高螺旋度后，多肽的细胞毒性随之上升，线粒体损伤加剧，进一步验证了螺旋度与细胞毒性的正相关关系。

图3：降低螺旋度减少多肽内化与线粒体损伤。 （A）NIH 3T3细胞经多肽处理后的代表性SEM图像； （B）多肽细胞内积累实验流程与共聚焦图像； （C）Cy5在细胞中的相对平均荧光强度； （D）细胞经多肽处理后的TEM图像； （E）JC-1染色显示线粒体膜电位变化。

图4：延长末端基团增加螺旋度并加剧线粒体损伤。 （A）C8–10与C10–10的化学结构； （B）多肽在有/无阴离子磷脂存在下的螺旋度； （C）对NIH 3T3细胞的IC₅₀； （D）对大肠杆菌的MIC值； （E）抗菌选择性指数； （F）JC-1染色显示线粒体膜电位变化。

在动物模型中，静脉注射C6–10未引起小鼠肝、肾、心等功能指标异常，组织切片也未发现病理改变。在膀胱感染和盲肠结扎穿刺（CLP）引发的败血症模型中，C6–10能显著降低膀胱内细菌负荷，并显著提高败血症小鼠的存活率，展现出良好的体内安全性与治疗效果。

图5：C6–10在细菌感染模型中的体内疗效。 （A–E）小鼠静脉注射PBS或C6–10后的血液生化指标； （F）膀胱感染模型构建与处理流程； （G）膀胱中细菌负荷； （H）CLP诱导的败血症模型构建与处理流程； （I）感染小鼠经PBS或C6–10处理后的存活率。

综上所述，该研究通过精准调控多肽的螺旋构象，成功开发出一种仅在细菌膜微环境中才激活的高选择性抗菌多肽。该策略有效解决了抗菌肽在强效杀菌与宿主毒性之间的平衡难题，为下一代智能型抗菌药物的设计提供了重要理论与实践基础。