神经环路应用（21）丨星形胶质细胞 Fos标记技术

对星形胶质细胞Fos标记技术工具的核心是通过Cre-loxP 重组系统结合AAV 病毒载体，可实现对激活状态（Fos 表达）星形胶质细胞的特异性标记。

案例解析

《The astrocytic ensemble acts as a multiday trace to stabilize memory》

研究目的：

此前缺乏能精准标记行为相关星形胶质细胞集合的工具，难以建立星形胶质细胞与行为的直接关联。Fos 基因作为 “即时早期基因”，其表达产物可作为细胞激活的分子标志物，若将 Fos 标记与星形胶质细胞特异性结合可得到标记行为相关星形胶质细胞集合的工具。

实验步骤：

动物品系：选用 8 周龄以上的 TRAP2（Fos-iCreERT2）转基因小鼠。

Fos启动子驱动的CreERT2：

小鼠的 Fos 基因启动子控制 CreERT2 的表达。Fos 是一种即早基因，当细胞（如神经元或星形胶质细胞）被激活时，其表达会迅速上调。CreERT2 是一种改良的Cre重组酶，它只有在结合了外源性药物他莫昔芬（4-OHT）后，才能进入细胞核并发挥作用，确保标记的时间特异性。

饲养条件：小鼠饲养于温度（23±3℃）、湿度（45±5%）可控的环境中，维持12 小时光-暗循环（7:00-19:00 光照），自由摄食饮水；若后续需进行光纤植入等手术，术后需单笼饲养。

AAV 病毒载体制备：

载体构建：采用 AAV-PHP.eB 血清型载体（具备全脑转导能力），携带星形胶质细胞特异性启动子GfaABC1D（仅在星形胶质细胞中驱动基因表达）、Cre 依赖的报告基因mNeonGreen（mNG）（绿色荧光蛋白，便于后续成像观察）及 WPRE 元件（增强基因表达效率）。

对照载体：同时制备空白载体（无 mNG 片段）或 Cre 非依赖型载体，用于排除病毒本身对细胞的影响及验证启动子特异性。

病毒注射阶段：

根据研究目标选择注射区域，若需全脑星形胶质细胞标记，通过眶后窦静脉注射方式注入 AAV-PHP.eB 载体，实现全脑转导；若需特定脑区（如杏仁核、海马）标记，需进行颅骨钻孔并定位。

术后恢复：

注射完成后缝合手术切口，用 70% 乙醇清洁皮肤，待小鼠自主苏醒后放回饲养笼，术后观察 2-3 天，确认无感染、出血等异常情况；病毒注射后需等待2-3 周，确保 AAV 载体在星形胶质细胞中充分表达（GfaABC1D 启动子驱动的 mNG 及 Cre 重组酶受体元件稳定表达）。

结合行为干预与标记诱导阶段

1.行为范式设计（激活星形胶质细胞 Fos 表达）

根据研究目标选择行为刺激以激活特定脑区星形胶质细胞，比如情境恐惧条件反射（FC）与恐惧回忆（FR）范式：

适应期（Habituation）：

实验前 3 天，每天将小鼠放入恐惧条件箱（CtxA）中适应 15 分钟，无电击刺激，降低环境新奇性引起的应激反应。

恐惧条件反射（FC）：

第 4 天（Day 4），将小鼠放入 CtxA，给予 3 次足底电击（每次 0.7 mA，持续 2 秒，间隔 30 秒），电击后停留 1 分钟再放回 home cage，通过电击刺激激活杏仁核、海马等脑区星形胶质细胞诱导 Fos 表达。

恐惧回忆（FR）：

FC 后 1 天（Day 5），将小鼠再次放入 CtxA（无电击），停留 15 分钟，通过情境线索唤起恐惧记忆，进一步激活星形胶质细胞 Fos 表达；设置对照组（NoFC：无电击；NoFR：FC 后不进行回忆）排除非特异性激活。

2. 4-OHT 注射诱导Cre重组（标记 Fos + 星形胶质细胞）

注射时机：

根据 Fos 表达时间窗口确定 4-OHT 注射时间，FR 后0-3 小时是星形胶质细胞 Fos 诱导的关键窗口，因此在 FR 结束后立即通过腹腔注射4-OHT。

标记后饲养：注射 4-OHT 后将小鼠放回 home cage，根据实验设计饲养特定时间（如 1 天、1 周），待 mNG 充分表达后进行后续检测。

Fig1 星形胶质细胞 Fos 标记工具验证

设置 4 个小鼠实验组：无恐惧条件反射组（NoFC，无电击）、恐惧条件反射组（FC，有电击）、无恐惧回忆组（NoFR，FC 后不进行回忆）、恐惧回忆组（FR，FC 后进行回忆），通过组间对比排除非特异性 Fos 激活。

标记完成后可进行STPT（串行双光子断层扫描）、全脑 3D 重建、脑区分割（覆盖 677 个亚区）及单细胞计数，最终实现 “行为-细胞-全脑分布” 的关联分析。

行为学验证（确保恐惧模型有效性）

通过 “僵直行为”（恐惧记忆的经典行为指标）验证实验模型的可靠性：证明电击成功诱导恐惧反应，排除 “环境新奇性” 等非恐惧因素的干扰。回忆阶段，休克组小鼠僵直率显著高于非休克组，证实恐惧记忆稳定形成，为Fos标记提供行为学依据。

全脑3D成像（标记细胞的空间分布）

星形胶质细胞 Fos 标记工具全脑特异性的直观证明可呈现了关键脑区的 Fos-mNG 星形胶质细胞分布：

成像区域：聚焦记忆相关核心脑区海马（HPC，空间记忆）、杏仁核（恐惧记忆核心脑区）、初级视觉皮层（VISp，情境识别）。

优势

高特异性：结合 Fos 基因的活性依赖性与 GfaABC1D 启动子的细胞特异性，仅标记 “激活状态的星形胶质细胞”，可助力全脑尺度分析激活星形胶质细胞的分布规律。

行为关联性：通过 4-OHT 注射的时间调控，可精准标记特定行为（如恐惧回忆）触发的激活细胞，建立 “行为-细胞激活” 的直接关联，为研究细胞集合与行为的因果关系提供工具支撑。

文献引用：

1. Dewa, Ki., Kaseda, K., Kuwahara, A. et al. The astrocytic ensemble acts as a multiday trace to stabilize memory. Nature (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09619-2

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