神经环路应用（19）丨活性依赖的RAM-TetOff-ChR2 光遗传学标记系统

活性依赖的RAM-TetOff-ChR2 光遗传学标记系统是一种结合了神经元活动记录与精准操控的先进工具，用于研究特定行为或刺激下被激活的神经元群体。

通过病毒载体介导的活性依赖标记技术结合光遗传学工具，实现对小鼠海马体（齿状回，DG）和皮层（前边缘皮层，PrL）记忆痕迹的精准标记与操控。

标记技术核心原理

采用RAMTetOffChR2系统，其核心是通过“神经元活性触发基因表达”实现记忆痕迹（即特定情境下激活的神经元集群）的可视化与功能操控：

1. 活性依赖启动子（RAM）：RAM启动子受神经元活性相关蛋白（如Fos、Npas4）调控，仅在神经元被激活时驱动下游基因表达；

2. Tet Off调控系统：通过多西环素（DOX）饮食控制基因表达开关，撤去DOX时，d2TTA转录因子激活TRE启动子，使光敏感通道蛋白ChR2在活跃神经元中表达；恢复DOX饮食则关闭ChR2表达，固定记忆痕迹标记窗口；

3. 光遗传学功能化：ChR2表达后，可通过蓝光（473 nm）照射激活标记的神经元，实现对记忆痕迹的精准操控（如在条件化阶段重新激活痕迹并与电击配对）。

Fig1 小鼠在DG或PrL脑区注射RAM-ChR2病毒后，于停用DOX期间暴露于环境A以标记该环境激活的神经元

2天或14天后，在环境C中将光刺激与电击配对，建立恐惧记忆。两天后测试小鼠在环境A和B中的反应；再过两天，重复测试环境B，同时开启或关闭蓝光刺激，以评估记忆召回。

实验流程

1. 术前准备

（1）病毒载体构建与制备

使用AAV DJ血清型，携带pAAVRAMd2TTA::TREChR2WPREpA质粒，该载体含 “活性依赖 RAM 启动子 + Tet Off 调控系统 + 光敏感蛋白 ChR2”，仅在神经元激活时驱动 ChR2 表达；对照载体为pAAVhSynhChR2(H134R)eYFP由hSyn启动子驱动ChR2表达，实现“随机标记”（不依赖神经元活性）；

载体功能：ChR2与eYFP（增强黄色荧光蛋白）融合表达，eYFP用于后续组织学验证标记效率，ChR2用于光遗传学激活。

（2）动物预处理

DOX饮食适应：实验前小鼠长期维持含DOX（40 mg/kg）的饲料，确保术前Tet Off系统处于“关闭”状态（无ChR2表达）。

2. 立体定位手术：病毒注射与光纤植入

病毒微注射靶向DG与PrL），使用微量注射器，通过注射泵以0.1 μl/min的速率注入病毒，注射后保持移液器10分钟再缓慢撤回，确保病毒充分扩散至目标脑区，避免沿针道泄漏。

DG双侧植入光纤，分别位于左右脑半球DG注射位点上方，确保蓝光可覆盖双侧标记的记忆痕迹；PrL中线单侧植入光纤覆盖双侧PrL区域（因PrL位于中线附近，单侧光纤可实现双侧刺激）；

通过牙科水泥与颅骨螺钉将光纤固定，术后注射1 ml生理盐水（0.9%）补水，待小鼠苏醒后返回饲养室，术后监测3天确保健康恢复，3周后进行行为实验（等待病毒充分表达）。

3. 记忆痕迹标记：情境暴露与DOX调控

（1）标记窗口开启（撤去DOX）

DOX撤去时机：行为实验前48小时，将小鼠饲料更换为无DOX的普通饲料，开启Tet Off系统，使RAM启动子可响应神经元活性驱动ChR2表达；

情境暴露标记：将小鼠置于“标记情境A”（31 cm×24 cm×21 cm，白色塑料侧与底板，室温，室内光照）中10分钟，此时小鼠在情境A中活跃的神经元（即编码情境A的记忆痕迹）会被RAM启动子驱动表达ChR2；

标记窗口关闭：情境暴露后立即将小鼠换回含DOX的饲料，关闭ChR2表达，确保仅标记“情境A暴露期间激活的神经元”，避免后续行为中其他神经元干扰。

4. 记忆痕迹功能验证：光遗传学激活与行为测试

（1）条件化阶段（痕迹激活与电击配对）

情境设置：条件化在独立的“情境C”中进行（32×25×25 cm，透明丙烯酸壁，不锈钢网格底板，60 dB背景噪音，无光照，仅近红外成像），避免与标记情境A、测试情境B混淆；

光刺激参数：

DG标记组：蓝光频率20 Hz，脉冲宽度15 ms，功率12 mW，持续刺激；

PrL标记组：蓝光频率4 Hz，脉冲宽度15 ms，功率12 mW，持续刺激；

电击配对：小鼠放入情境C后，分别在120 s、150 s、180 s时施加0.7 mA、2 s的足底电击，光刺激与电击同步进行，使“激活的情境A痕迹”与“电击恐惧”建立关联，形成“虚假记忆”（情境A未直接接触电击，但小鼠会对A产生恐惧）。

（2）测试阶段（痕迹分辨率评估）

测试情境：设置“目标情境A”（标记情境）与“相似情境B”（透明塑料饲养笼置于50×18×45 cm白色 chamber 中，弱光照），评估记忆痕迹的分辨率（高分辨率表现为仅在A中冻结，低分辨率表现为A与B中均冻结）；

测试时间点：

近期延迟：条件化后2天；

远程延迟：条件化后14天；

行为指标：

记录4分钟内的僵直行为，以“freezing_A vs freezing_B”的辨别指数反映分辨率。

（3）光遗传学重激活验证（补充验证标记效率）

目的：确认ChR2在标记神经元中有效表达且蓝光可激活痕迹引发恐惧行为；

测试情境A/B后1天，将小鼠置于情境B中8分钟，前4分钟无刺激，后4分钟施加蓝光刺激（参数同条件化阶段），手动计数冻结率（因光纤连接干扰自动追踪）；

验证标准：蓝光刺激期间的冻结率显著高于刺激前，证明ChR2标记成功且功能正常。

关键对照设计

为排除“非特异性标记”“情境熟悉度”等干扰因素，设置两类核心对照：

1. 无标记对照

小鼠暴露于情境A时不撤去DOX（RAM系统关闭，不标记神经元），其余流程（条件化、测试）与实验组一致；

目的：验证实验组中“情境A的高冻结率”源于“记忆痕迹标记与激活”，而非“境A的自然熟悉度”。

2. 随机标记对照

注射AAVhSynChR2病毒（hSyn启动子驱动ChR2，随机标记神经元不依赖活性），其余流程与实验组一致；

目的：验证实验组中“分辨率变化”源于“活性依赖的记忆痕迹标记”，而非“随机神经元激活”。

标记效率验证（组织学方法）

行为实验结束后，通过组织学检测确认记忆痕迹标记的特异性与效率。

标记效率量化，计数指标：

标记细胞比例：ChR2阳性细胞（GFP+）占总神经元（NeuN+）的百分比DG中约4%，PrL中约10%；

标记区域特异性：ChR2阳性细胞仅分布于DG颗粒细胞层/门区、PrL皮层，无其他脑区泄漏，证明标记的脑区特异性。

文献引用：

• Golbabaei A, Coelho CAO, de Snoo ML, Josselyn SA, Frankland PW. Neurogenesisdependent transformation of hippocampal memory traces during systems consolidation. bioRxiv [Preprint]. 2025 Jun 6:2025.06.05.658072. doi: 10.1101/2025.06.05.658072. Update in: Curr Biol. 2025 Sep 30:S09609822(25)011753. doi: 10.1016/j.cub.2025.09.005. PMID: 40501658; PMCID: PMC12157470.

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