研究发现：大和米蕈通过诱导细胞凋亡与抑制NF-κB通路作用鼠肝癌

肝癌是全球范围内影响人数众多的重大疾病。根据世界卫生组织（WHO）数据，原发性肝癌（即肝细胞癌HCC）位列全球癌症死亡第三位。目前治疗HCC最常用的是阿霉素、5-氟尿嘧啶和顺铂等化疗药物。然而这类全身化疗方案对肝癌疗效有限，且仅能缩小肿瘤的很小部分。因此，开发能精准打击癌细胞、安全无毒的新品已成为业界迫切需求。

一项为期三年的临床试验针对HCC患者，旨在评估肝癌药物与天然产物大和米蕈（MGN-3/Biobran）的联合疗效。研究表明，与单独化疗的患者相比，联合治疗能有效降低疾病复发率、提高生存率，并显著降低甲胎蛋白水平。

大和米蕈（MGN-3/Biobran）作为无毒抗癌剂，其多种生物活性已得到长期研究验证。在小鼠实验中，它对实体埃利希癌和神经母细胞瘤表现出抗肿瘤活性，能增强放疗引发的肿瘤消退效果，并强化低剂量紫杉醇对肿瘤细胞的凋亡作用。

在先前的初步研究中，科研人员发现大和米蕈（MGN-3/Biobran）对N-亚硝基二乙胺（NDEA）与四氯化碳（CCl 4）联合作用引发的大鼠肝癌发生具有保护作用。具体而言，大和米蕈（MGN-3/Biobran）能逆转这种致癌物对体重、肝脏重量及肝酶水平的负面影响。

本研究旨在探究大和米蕈（MGN-3/Biobran）对化学诱导大鼠肝癌发生保护作用的具体机制。科研人员重点考察了大和米蕈（MGN-3/Biobran）通过诱导肝癌细胞凋亡这一核心分子机制发挥保护作用，并评估了其通过抑制IkB-αmRNA表达及后续阻断NF-κB信号通路产生的抗炎效应。

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材料和方法

1、大和米蕈（MGN-3/Biobran）

大和米蕈（MGN-3/Biobran）是一种由β1,3-葡聚糖和活性半纤维素组成的多糖。该制剂通过将米糠经香菇提取物酶解处理获得。研究人员将新鲜配制的大和米蕈（MGN-3/Biobran）溶于0.9%生理盐水后，以25毫克/千克体重/天的剂量每周五次通过腹腔注射，每次注射0.2毫升。

2、动物

本研究选用90只4月龄雄性Wistar大鼠（体重约120克），实验动物购自埃及吉萨眼科研究所，实验前经过一周适应期。大鼠单独饲养于恒温恒光（20±2℃）的笼舍中，每日喂食标准实验室颗粒饲料。

3、肝癌发生诱导

研究人员通过腹腔注射给大鼠单次给予致癌化合物N-亚硝基二乙胺（NDEA）（200毫克/千克体重）。一周后，动物每周接受一次碳四氯化碳（CCl 4）（3 ml/kg体重）皮下注射，持续6周。

4、实验设计

研究人员将90只大鼠随机分为五个实验组。

对照组（15只）作为未处理组。

第二组（15只）仅通过腹腔注射给予大和米蕈（MGN-3/Biobran）（25毫克/千克体重/天），每周注射五次。

第三组（20只）仅注射致癌物（NDEA+CCl 4）。

第四组（20只）从致癌物注射前两周开始，每周五次给予大和米蕈（MGN-3/Biobran）（25毫克/千克体重/天），持续20周。

第五组（20只）从致癌物注射后第10周开始，每周五次给予大和米蕈（MGN-3/Biobran）（25毫克/千克体重/天），直至实验结束。

具体时间安排详见图1。实验期间持续监测体重变化（数据未展示）。

图1：实验方案示意图。

5、样本集

经过22周的实验研究，实验动物在使用乙醚麻醉前需禁食。研究人员首先对动物进行称重，随后实施解剖操作。从每只大鼠肝脏中取出组织样本，用冰盐水清洗后擦干并称重。

肝组织检测参数包括：组织病理学分析、细胞周期进程流式细胞术检测、细胞凋亡分析、凋亡与细胞增殖相关蛋白调控因子（p53、Bax、Bcl-2、caspase-3及NF-κB/p65表达）的检测，以及通过逆转录聚合酶链反应（RTPCR）测定p53、Bax、Bcl-2、caspase-3和IκB-α的相对基因表达水平。DNA损伤检测采用凝胶电泳法，同时通过免疫染色法检测NF-κB/p65表达。

6、组织病理学

为进行组织学处理，研究人员采集了不同组别的肝脏样本。将组织切成小块后立即置于10%中性福尔马林缓冲液中固定24小时。固定完成后，样本依次经过70%-95%浓度梯度乙醇脱水处理，随后两次更换为无水乙醇。

组织样本经二甲苯透明化处理后，包埋于石蜡中。使用切片机制备4厚度为5μm的切片，载玻片固定后采用苏木精-伊红（H&E）染色法进行组织病理学观察，并通过马松三色染色法检测胶原纤维。

7、流式细胞术研究：肝细胞制备

从不同组的肝脏中取出组织样本，切成小块，并用细尼龙纱布（40–50目/cm）轻轻擦拭。样本用pH 7.5的Tris-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA）缓冲液（3.029克0.1 M Tris-（羟甲基氨基甲烷）、1.022克0.07 M盐酸和0.47克0.005 M Tris-EDTA）通过纱布洗涤。细胞悬浮于无菌PBS中，以1800转/分钟离心10分钟，重悬于PBS（细胞密度约1×10 4个细胞/毫升），并用70%冰乙醇（与PBS混合）固定，保存于-20°C直至分析。

8、细胞周期分析

将肝细胞悬液离心后，取细胞沉淀重悬于1毫升碘化丙啶（PI）溶液中，避光孵育30分钟。后续实验采用流式细胞术进行检测，数据通过MODFIT细胞分析软件处理。

软件会计算每个样本中DNA细胞周期各阶段（G0/G1、S期、G2/M期）的变异系数及细胞占比。当出现与G1期二倍体峰分离的明显峰，且其与二倍体内部标准偏差超过10%；或G1峰与对应G2/M峰偏差超过10%时，则判定存在非整倍体细胞群。

9、细胞凋亡的定量测定

为定量检测大和米蕈（MGN-3/Biobran）治疗对肝癌细胞凋亡的影响，科研人员采用流式细胞术结合Annexin-V偶联Alexafluor 488凋亡检测试剂盒，严格按照说明书操作。

实验中，早期凋亡细胞会呈现Alexa488荧光绿色，定位在荧光激活细胞分选直方图的右下象限；晚期凋亡细胞则同时呈现Alexa488和碘化丙啶荧光，呈现红绿色，位于直方图的右上象限。

10、凋亡调节因子的流式细胞分析

本研究使用的凋亡相关蛋白小鼠抗体，包括p53抗体sc-7480、Bax抗体sc-7480、Bcl-2抗体sc-7382、caspase-3抗体sc-7272及NF-κB/p65抗体sc-8008。流式细胞检测所用的二抗为荧光素（异硫氰酸荧光素，简称FITC）标记物。

11、凋亡调控因子及IκB-α基因的实时RT-PCR分析表达

凋亡调控因子的RT-PCR分析严格遵循制造商操作指南进行，总RNA提取采用GF-TR-050总RNA提取试剂盒。总RNA经FastQuant RT试剂盒逆转录生成cDNA，该试剂盒含gDNase酶，通过42℃孵育3分钟去除基因组DNA，有效避免基因组DNA干扰。RT-PCR反应使用Maxima SYBR Green qPCR预混试剂（2×），反应条件与数据分析均按制造商说明书规范执行。

将μl ofcDNA加入25μl总体积的反应体系中，该体系包含12.5μl Maxima SYBR Green qPCR预混液（2×）、0.3μMol正向引物、0.3μMol反向引物（引物序列详见表1）以及10 nM/100 nM ROX荧光染料溶液，并用无核酸酶水补足至25μl。

表1：RT-PCR所用引物序列。

12、凝胶电泳检测DNA损伤

肝组织DNA提取采用天根基因组DNA试剂盒，严格按说明书操作。通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（按碱基对长度区分），实现样品可视化与纯化。使用DNA分子量标准品测定片段长度，电泳完成后通过Gel Analyzer Pro v3.1凝胶分析系统自动检测各泳道及条带。

13、NF-κB/p65表达的免疫组化检测

将肝组织切片置于带正电荷的载玻片上，与抗NF-κB/p65小鼠单克隆抗体（货号sc-8008）共同孵育。

采用链霉亲和素-生物素法进行免疫组化染色，使用含10%非免疫血清、生物素化二抗及链霉亲和素-过氧化物酶的Histostain-plus试剂盒。以DAB作为显色剂，迈尔苏木精作为复染剂。

随后通过光学显微镜观察载玻片，结果显示NF-κB/p65在肝组织细胞质中表达，阳性NF-κB信号呈棕褐色。阳性细胞比例低于5%的切片判定为阴性。

结果

1、肝脏相对重量（RLW）

与对照组相比，暴露于致癌物（NDEA+CCl 4）的大鼠的RLW显著增加。然而，无论是在致癌物暴露前还是暴露后给予大和米蕈（MGN-3/Biobran），RLW的增加均恢复正常，处于正常对照值范围内（图2）。

图2：相对肝脏重量。每个数值代表相应动物组的平均值±SE：对照组（13）、单独使用大和米蕈（MGN-3/Biobran）（13）、致癌物（15）、Biobran后致癌物（18）、致癌物后大和米蕈（MGN-3/Biobran）（17）。

2、细胞周期进程和细胞凋亡

本研究考察了致癌物与大和米蕈（MGN-3/Biobran）对正常肝细胞及肿瘤肝细胞不同细胞周期阶段的影响。

表2数据显示，在致癌物存在条件下，大和米蕈（MGN-3/Biobran）处理导致细胞周期停滞于亚G1期。与单独使用致癌物的对照组相比，经预处理组的亚二倍体细胞比例显著增加126%，经后处理组则增加99%（p<0.01）。

值得注意的是，致癌物处理组在使用大和米蕈（MGN-3/Biobran）后，虽未出现细胞周期停滞现象，却导致肿瘤细胞周期状态（G0/G1、S期及G2/M期）发生紊乱。

表2：各组肝脏组织的细胞周期进程与凋亡情况。每个数值代表6只大鼠/组的平均值±标准误。

3、AnnexinV/PI染色法定量检测细胞凋亡

表3数据显示，与未处理的致癌物组相比，经大和米蕈（MGN-3/Biobran）预处理或后处理的致癌物组早期凋亡细胞比例分别显著增加316%和309%（p<0.01）。

晚期凋亡细胞比例在致癌物+大和米蕈（MGN-3/Biobran）组中显著增加237%（p<0.01），而大和米蕈（MGN-3/Biobran）预处理组【致癌物+大和米蕈（MGN-3/Biobran）】的晚期凋亡细胞比例增幅更大，达到255%（p<0.01），明显高于未处理组。

表3：通过Annexin V/PI双染色法对不同组别肝脏组织的细胞凋亡进行流式细胞术分析。各组数据均以6只大鼠的平均值±标准误表示。

4、凋亡调节因子的流式细胞分析

通过流式细胞术检测了致癌物和大和米蕈（MGN-3/Biobran）对正常肝细胞与肿瘤细胞凋亡调控因子表达百分比的影响。

表4结果显示，大和米蕈（MGN-3/Biobran）在体内通过线粒体依赖性通路诱导肝癌细胞凋亡，且预处理效果显著优于后处理：

p53表达量分别增加107%和77%，Bax表达量分别增加129%和108%，Bcl-2表达量分别降低48%和51%，Bax表达量分别增加129%和108%，Bcl-2表达量分别降低48%和51%，Bcl-2表达量分别降低48%和51%，Bcl-2表达量分别降低48%和51%。

表4：不同组别肝脏组织中凋亡调控因子的流式细胞术分析。每个数值代表6个肝脏样本/组的平均值±标准误。

5、凋亡调节因子的相对基因表达

科研人员采用RT-PCR技术检测了致癌物与大和米蕈（MGN-3/Biobran）对不同实验组肝脏组织中凋亡调控基因相对表达水平的影响。

如表5所示，未处理的致癌物组中p53、Bax和caspase-3基因表达水平较低，而Bcl-2基因表达水平较高。经大和米蕈（MGN-3/Biobran）预处理后，与未处理组相比，p53、Bax和caspase-3基因表达分别显著上调143%、80%和96.71%（p<0.01），Bcl-2基因表达水平则下降53%。同样地，大和米蕈（MGN-3/Biobran）后处理组在p53、Bax和caspase-3基因表达方面也显示出显著上调（p<0.01），但Bcl-2基因表达水平的下调幅度较小。

表5：本研究通过RT-PCR技术检测不同处理对大鼠肝脏组织中p53、Bax、Bcl-2和caspase-3基因相对表达的影响。以GAPDH作为内参基因进行定量分析，数据以对照组为基准，以百分比形式呈现表达量变化。正常对照组的相对基因表达量设定为1，各组数据均代表5个肝脏样本的平均值±标准误。

6、NF-κB/p65表达的流式细胞术与免疫组化检测

流式细胞术检测显示，与未处理的致癌物组相比，经大和米蕈（MGN-3/Biobran）预处理组和后处理组的肝细胞中NF-κB/p65蛋白水平分别显著下调46.08%和38.87%（图3A）。对对照组和大和米蕈（MGN-3/Biobran）处理组大鼠肝组织进行免疫组化分析发现，肝细胞胞质中NF-κB/p65均呈阴性表达。致癌物处理组的肝组织。

经大和米蕈（MGN-3/Biobran）处理的大鼠在炎症和纤维化区域表现出强烈的细胞质NF-κB/p65免疫反应活性。大和米蕈（MGN-3/Biobran）处理降低了细胞质NF-κB/p65的表达，在少数肝细胞中显示弱阳性免疫反应活性，处理前为阴性，处理后为轻度阳性（图3 B）。

图3：(A)流式细胞术检测各组肝脏组织中NF-κB/p65的表达水平。每个数值代表6个肝脏样本/组的平均值±标准误。(B)NF-κB/p65在肝脏组织中的免疫组化检测结果。

7、IκB-α的相对基因表达

图4通过RT-PCR技术展示了不同组别肝脏组织中IκB-α基因表达的定量检测结果。单独使用大和米蕈（MGN-3/Biobran）处理的动物，其IκB-α基因表达水平与正常对照组相比未见显著变化。

当向大鼠注射致癌物后，IκB-α基因表达水平显著下降（p<0.01），降至0.53±0.03。在致癌物注射前两周开始并持续整个实验周期的大和米蕈（MGN-3/Biobran）给药，成功逆转了IκB-α基因表达的下降趋势，与未处理组相比实现了131%的显著上调。

值得注意的是，与未处理组相比，大和米蕈（MGN-3/Biobran）的后期给药可抵消致癌物对IκB-α基因表达的抑制作用，使其表达水平回升76.57%。

图4：通过RT-PCR测定不同处理对大鼠肝脏组织中IκB-α基因相对表达的影响。每个数值代表5个肿瘤样本/组的平均值±SE。a，与对照组相比，p<0.05，p<0.01，分别具有显著差异。b，与大和米蕈（MGN-3/Biobran）组相比，p<0.05，p<0.01分别具有显著差异。c，与致癌物组相比，p<0.05，p<0.01水平上显著不同。d，与大和米蕈（MGN-3/Biobran）组相比，Carcinogen组在p<0.05水平上存在显著差异。

8、凝胶电泳检测DNA损伤

通过凝胶电泳技术检测不同处理组肝脏组织的细胞核DNA片段化情况，并使用Image J软件进行图像分析。DNA琼脂糖凝胶电泳是检测细胞凋亡的特异性方法，其特征性DNA梯状图谱可作为凋亡标志。

图5：采用Image J软件对大鼠肝脏组织进行凝胶电泳分析后获得的DNA片段化百分比。数据为3次不同凝胶电泳运行的平均值±标准误。

9、肝脏病理学

致癌物在大鼠肝脏中诱发了多种增殖性病变和癌前病变。图6（左垂直面板A-E）展示了肝脏病理学数据。正常对照组肝脏未见异常(A)。大和米蕈（MGN-3/Biobran）处理组大鼠的肝切片显示肝脏结构正常(B)。

致癌物处理组出现肝脏结构破坏，形成由纤维隔分隔的增生性结节，伴有浸润性炎性细胞和胆管增生。致癌物处理引发脂肪变性，特征包括无区域分布的大小液滴状巨泡性脂肪变性、局灶性肝细胞胞浆空泡化、核形态异型及频繁的有丝分裂活动(C)。

在注射亚硝胺前使用大和米蕈（MGN-3/Biobran）处理组未出现脂肪变性，肝脏结构完整，仅存在轻微核改变和炎症反应(D)。亚硝胺注射后使用大和米蕈（MGN-3/Biobran）处理组脂肪变性减轻，仅可见少量脂滴（LD），并伴有中度门静脉炎症浸润（以淋巴细胞为主）及少量肝细胞变性(E)。

肝纤维化导致肝脏结构异常(H)。另一方面，预先用大和米蕈（MGN-3/Biobran）处理的动物肝脏组织显示，癌物处理组的中心静脉周围仅有少量胶原纤维沉积，表明大和米蕈（MGN-3/Biobran）能有效防止肝脏进行性纤维化(I)。与仅用癌物处理的动物相比，接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）后处理的动物在充血的中心静脉周围也显示出中等程度的胶原纤维沉积(J)。

图6：左侧垂直面板展示经H&染色的肝脏切片代表性显微照片

结论

科研人员得出结论：大和米蕈（MGN-3/Biobran）能够通过诱导细胞凋亡、抑制炎症反应和癌细胞增殖，有效阻断致癌物（NDEA与CCl 4联合使用）引发的肝癌发生。

肝脏组织的分子机制研究表明，大和米蕈（MGN-3/Biobran）可逆转致癌物对IκB-α（IκB-α）基因表达的抑制作用，下调核因子κB（NF-κB/p65）和Bcl-2的表达水平，同时上调p53、Bax及caspase-3的基因表达量和蛋白水平，并增强基于核DNA片段化的细胞凋亡过程。

这些发现表明，大和米蕈（MGN-3/Biobran）有望成为预防和治疗肝癌发生的新型化学预防剂和化疗药物。

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免责声明：大和米蕈LENTIN Plus 1000LY作为一款免疫调节剂，属于保健食品，不能代替药物治疗疾病，大家应理性对待。