【文献学习】成人脑胶质瘤颅外转移的临床、影像学及分子特征分析

研究背景与目的

成人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤，其中胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）最常见且恶性程度最高，中位总生存期仅14.6个月。其治疗面临化疗耐药、浸润性生长等多重挑战，而胶质母细胞瘤的颅外转移较为罕见（发生率0.4%-0.5%），其临床特征、生物学机制及肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的特征仍缺乏系统认知。

在生理层面，血脑屏障、硬脑膜等生理屏障理论上可阻止肿瘤细胞扩散，但临床已观察到20%-39%的GBM患者存在循环肿瘤细胞，且有胶质母细胞瘤通过器官移植传播的案例。外科干预（如神经外科开颅手术、脑室腹腔分流术）被推测为潜在转移诱因，但无手术史患者的转移案例也提示肿瘤自身具备转移潜能。此外，传统研究多依赖免疫组织化学（IHC），且局限于个案分析，全基因组DNA甲基化谱等前沿技术在胶质瘤转移研究中应用极少，TME中免疫细胞与肿瘤干细胞样细胞的作用亦未明确。

基于上述研究空白，本研究旨在通过多种技术（NGS、全基因组甲基化、RNA测序、IHC等），对迄今规模最大的成人转移性胶质瘤队列进行分析，以阐明转移灶的克隆起源、表观遗传、转录及TME特征，为临床诊断与治疗提供依据。

材料与方法

1.患者队列与样本

本研究初始纳入20例成人转移性胶质瘤，排除2例组织样本不足及2例非转移肿瘤（脑脊液播散、通过脑室腹腔分流管播散）后，最终纳入16例患者（1999-2019年，丹麦哥本哈根大学医院），包括14例GBM（IDH野生型，WHO4级）及2例低级别胶质瘤（1例IDH突变星形细胞瘤，WHO 2-3级；1例IDH突变，1p/19q缺失少突胶质细胞瘤，WHO 2-3级）。样本类型为配对的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织：原发肿瘤、颅内复发肿瘤（优先最新的复发肿瘤，2例因原发肿瘤不足用首次复发肿瘤替代）、转移灶（5例手术切除，2例尸检获取）。2名神经病理学家按2021年WHO中枢神经系统肿瘤分类重新评估，必要时补充胶质纤维酸性蛋白（GFAP）染色验证。

2.研究技术与方法

（1）影像学评估

分析原发肿瘤以及转移肿瘤的MRI影像，包括T1增强、T2、FLAIR序列。分析强化模式、中央坏死、FLAIR/T2不匹配现象、肿瘤占位效应与体积。并评估肿瘤与硬脑膜、脑室、大血管的距离，以探究转移途径。

（2）分子检测

包括DNA提取、二代测序（NGS）、全基因组DNA甲基化谱（Illumina Infinium MethylationEPIC（850K）芯片检测）、RNA测序，具体细节详见原文。

研究结果

1.临床特征

转移部位分布：转移至头皮/上颈部8例（50%）、淋巴结转移5例（31.25%）、骨转移2例（12.5%）、肝转移1例（6.25%）【图1A】。8例头皮/上颈部转移中6例存在颅内病灶经颅骨钻孔延伸至颅外现象，此类肿瘤非真性转移。其余10例为真性转移（原发灶与转移灶无解剖连接）【图1B】。

图1：患者特征概述。（A）转移部位概述；（B）MRI扫描（T1增强）显示强化肿瘤通过开颅术钻孔延伸，伴颅外强化肿瘤（箭头）（左）；远处脊柱骨性转移伴硬膜外压迫（箭头）（平扫）（右）；（C）Kaplan-Meier曲线显示胶质母细胞瘤患者的总生存期，其中包括真性转移（8例）和颅外延伸（6例）（log-rank p=0.028）。（显著性水平p<0.05）。（D）患者疾病发展的时间线，从确诊到死亡，包括开颅术时间点（组织病理学报告日期）。

病理亚型：14例GBM中6例表现为肉瘤分化（符合胶质肉瘤GS亚型）。2例低级别胶质瘤均进展至高级别（WHO 3级）。

人口学与生存情况：男12例、女4例，诊断中位年龄为56.5岁（27-65岁）。颅外延伸组开颅手术次数显著多于真性转移组（3 vs 2，p=0.0450），且总生存期（OS）更长（17.5 vs 7.5个月，p=0.0288）【图1C】。GBM患者中位OS为12.5个月（范围5-44个月），转移后中位生存期86天（15-200天）；2例低级别胶质瘤OS分别为147个月、35个月【图1D】。

治疗与分子标志物：11例患者初治方案包括放疗联合替莫唑胺化疗。GBM中MGMT启动子甲基化率14%（2/14），低级别胶质瘤中为100%（2/2）。4例GBM存在TERT启动子热点突变【表1，详见原文】。

2.影像学特征

在肿瘤转移途径方面，未发现肿瘤与硬脑膜、脑室、大血管的距离与转移能力的相关性，但6例颅外延伸患者中，5例在手术钻孔处观察到异常强化，提示肿瘤沿手术路径生长。1例颅外延伸患者见颅底强化，但与钻孔关联不明确。原发肿瘤影像学均符合高级别胶质瘤典型特征，包括对比增强、中央坏死、FLAIR序列高信号（提示瘤周水肿）；无FLAIR/T2不匹配现象（IDH突变型胶质瘤的特征性标志）；肿瘤体积22.0-104.4cm³，与非转移GBM体积分布无明显差异。

3.克隆起源与遗传特征

本研究对肿瘤的突变谱进行分析，共检测413个基因的1491个非同义体细胞突变，高频突变为PIK3CA、EGFR、PTEN、NOTCH1、SMARCA4【图2A】。未发现DNA损伤修复通路（如错配修复）突变，亦无微卫星不稳定性（MSI）证据。同源重组通路亦无异常。颅外延伸组的原发肿瘤TMB有升高趋势，但无统计学意义。

4例肿瘤存在TERT启动子热点突变。在13例GBM中，有8例的关键拷贝数变异（CDKN2A/B纯合缺失、+7/-10染色体异常、EGFR扩增）完全保留【图2B】。所有患者肿瘤的MGMT甲基化状态在疾病进展过程中保持稳定。

研究者对6名患者纵向采集的肿瘤样本的变异等位基因频率和拷贝数动态变化进行研究，以探索驱动肿瘤进展和转移的机制。5名患者的颅内复发肿瘤和转移肿瘤均起源于原发肿瘤。仅有2名患者的颅内复发肿瘤缺乏致癌基因突变【图2C，详见原文】。这表明胶质瘤的转移起源于原发肿瘤。

图2A-B：转移性成人胶质瘤的分子特征。（A）Oncoprint图显示原发、复发及颅外转移灶的突变图谱。每列对应单个样本，按患者系统排列；y轴列出临床相关突变基因，不同颜色代表临床信息和突变功能；（B）通过DKFZ脑肿瘤分类器V.12.5鉴定的差异肿瘤亚群关键分子特征。

4.表观遗传动态（甲基化谱改变）

甲基化谱分析显示，68%（21/31）的肿瘤的甲基化类别可以可靠地进行归类（DKFZ分类器得分≥0.84）。原发GBM中最常见的甲基化类别为GBM_MES型（间质型，43%）与GBM_RTK2型（21%），转移灶中两类别的分布比例相似（MES型43%、RTK2型14%）。

平均肿瘤纯度15%-92%，原发、复发、转移灶间无显著差异。但肿瘤纯度与甲基化类别得分显著相关（R=0.3564，p=0.0490），提示纯度可能影响甲基化分类的可靠性。

对所有样本中变异程度最高的1%的探针进行无监督聚类分析，显示8/14例患者的甲基化特征呈“患者特异性稳定”（同一患者的不同阶段样本聚类在一起）【图3A】；另外6例患者的甲基化特征不稳定，其中2例（患者8、15）在进展过程中发生甲基化类别转变（如从GBM_RTK2转为GBM_MES）【图3B】。

研究者在原发灶与转移灶间共鉴定60724个差异甲基化位点，其中多数（>90%）在转移灶中呈低甲基化，提示肿瘤进展过程中存在全基因组DNA甲基化水平的下降。

图3：原发脑肿瘤、颅内复发灶和转移灶的全基因组DNA甲基化谱分析。（A）热图显示甲基化特征中变异度前1%探针的无监督层次聚类；（B）Sankey图显示DKFZ脑肿瘤分类器V.12.5预测的原发脑肿瘤、颅内复发灶和颅外转移灶的甲基化分类。

5.RNA测序揭示肿瘤进展过程中的亚型转换

对5例GBM的ssGSEA分析显示，2例原发肿瘤为经典亚型，在复发和转移中转变为间质亚型。1例不能获得原发肿瘤，以第一次复发肿瘤代替。该肿瘤在进展过程中保持经典亚型特征。相反的是，2例原发肿瘤为间质亚型，1例转移病灶保持了间质亚型，另1例的复发病灶为经典亚型，转移病灶又转换为间质亚型。这说明转录亚型存在动态的转换【图4A，详见原文】。

为探索真性转移病灶和颅外延伸病灶是否由不同的转录程序激活，研究者对真性转移和颅外延伸组的原发肿瘤【图4B，详见原文】以及复发、转移肿瘤【图4C，详见原文】进行ssGSEA分析。真性转移组的原发肿瘤中上皮-间质转化（EMT）通路激活程度显著更高（p<0.05），另外TGFβ信号传导、γ干扰素反应、IL2-STAT5信号等炎症相关通路激活。综上，进展和转移过程中存在转录可塑性以及RNA亚型转换的证据。

6.肿瘤干性特征保持稳定

基于甲基化干细胞特性估计值以及细胞标志物（SOX2、OLIG2）和神经元标志物MAP2的的IHC结果显示，在进展及转移过程中干细胞特性未显示出差异。这表明肿瘤的干细胞特性并非GBM发生转移的关键驱动因素。

7.肿瘤微环境（TME）特征

肿瘤微环境被认为与转移的发生有关。细胞类型解卷积显示，原发和转移肿瘤中均以单核细胞来源的细胞为主导；NK细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞来源的细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞在疾病变化中水平相似，组间无显著差异【图5A】中无显著变化。仅颅内复发灶中B细胞比例显著降低（p<0.05）。

通过定量分析免疫细胞标志物以研究免疫细胞组成。结果显示显示，CD8+T细胞、FOXP3+调节性T细胞和CD68+巨噬细胞的数量在原发、复发和转移肿瘤中无显著变化【图5B-D，详见原文】。与颅外延伸组相比，真性转移组原发肿瘤的CD68 +巨噬细胞水平显著降低（p=0.01，图5D），且真性转移组转移肿瘤的CD68+巨噬细胞密度低于复发肿瘤（p=0.04）。

8. GFAP表达变化

与原发脑肿瘤相比，所有转移灶中GFAP表达显著降低或完全缺失，2例低级别胶质瘤转移灶亦呈现相同模式。这说明肿瘤进展会导致星形胶质细胞样分化的丧失。

图5A：小提琴图和比例图显示原发肿瘤和转移灶中B细胞、NK细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、单核细胞衍生细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的细胞类型反卷积比例。中位数以水平线显示，第25和75百分位数以虚线水平线显示。患者3和13的原发肿瘤无细胞类型反卷积数据，比例图中显示为空白柱。

讨论与结论

本研究证实，成人胶质瘤可出现真性的颅外转移，以及向颅外延伸。颅外延伸组的预后相对较好。由于复发胶质母细胞瘤需要更多开颅手术治疗，增加了向颅外延伸风险。值得关注的是，有2例存在头皮病灶患者，最初被认为真性转移。但进一步影像学检查提示头皮肿瘤均靠近颅骨钻孔，因此可以用沿手术路径种植来解释。另外肿瘤通过脑膜淋巴管扩散也可能是转移途径之一。

本研究对转移性胶质母细胞瘤的MRI特征特征进行分析，发现诸多与转移性胶质母细胞瘤显著相关的典型征象，如不均匀强化、中央坏死及明显占位效应等，这些表现与胶质母细胞瘤已确立的影像学表现一致，常表现为血脑屏障破坏以及坏死核心被周围存活的肿瘤组织环绕。肿瘤体积范围广泛，与文献中报道的非转移性胶质母细胞瘤体积情况相符，这表明肿瘤体积并不影响其转移潜能。

通过对连续肿瘤样本进行突变分析，在5名患者中发现原发肿瘤是转移肿瘤的克隆起源，且复发和转移瘤是平行演化的。甲基化谱分析显示，至少有2例胶质母细胞瘤在转移过程中发生了甲基化类别转变。此前已有研究表明，胶质母细胞瘤在复发时可能会发生甲基化类别转变，而本研究首次表明这种转变也可能发生在转移过程中。在肿瘤进展和转移过程中存在全基因组DNA甲基化水平的下降，仍需进一步研究这一现象在胶质母细胞瘤转移中的作用。另外肿瘤进展及转移过程中存在亚型的动态转换，尽管样本量有限，但总体趋势是向间质亚型转变。

在真性转移瘤中，上皮-间质转化（EMT）通路被激活的现象更显著，这可能表明EMT通路的激活在真性转移瘤的发展中起着重要作用。同样的分析还显示，在发生真性转移的患者中，各种免疫反应通路的表达上调，尽管样本量有限无法得出确切结论，但这可能意味着与颅外延伸相比，真性转移时免疫微环境的参与更为积极。

关于干细胞特性的分析中，基于甲基化的干细胞指数以及对细胞标志物OLIG2和SOX2的定量检测结果均显示，原发、复发和转移瘤之间无显著差异。研究结果表明，干细胞特性并非胶质母细胞瘤转移进程迄今为止的驱动因素。

至今为止，尚无研究分析胶质母细胞瘤转移病灶的免疫微环境与原发肿瘤的差异。本研究发现原发肿瘤和继发肿瘤的免疫细胞组成惊人地相似。因此，广为接受的“免疫豁免脑”这一概念似乎并不适用于发生转移的胶质母细胞瘤。不过，出现颅外延伸的患者原发肿瘤中CD68+巨噬细胞的水平高于真性转移。鉴于巨噬细胞可促进肿瘤细胞迁移，可以推测它们可能参与了向颅外延伸的过程。

本研究结果表明上皮间质转化参与了胶质瘤的转移。多个转移灶GFAP的表达降低，这反映了肿瘤进展过程中星形胶质细胞样分化的丧失。本研究的甲基化分析表明甲基化类别向间质亚型转变，显示胶质瘤在发展和转移过程中在表观遗传水平上具有可塑性。在转录水平上也观察到了同样的模式。我们的队列中还包含异质性多的胶质肉瘤，我们推测这种亚型特有的间质成分增加了转移的可能性。

总之，本研究证明原发肿瘤是胶质瘤转移病灶的克隆起源。胶质瘤向颅外延伸与真性转移是不同的。另外肿瘤发展过程中存在表观遗传和转录亚型的可塑性。而肿瘤微环境中的免疫细胞成分不受转移部位的影响，这表明未来针对胶质瘤的肿瘤微环境导向疗法可能对转移灶也有效。

参考资料：Clinical, radiological, and molecular insights into extracranial metastases from adult gliomas. Neuro-Oncology,2025. doi:10.1093/neuonc/noaf178

敬请注意：本文仅供相关专业人员学习参考之用，文中的所有信息均不作为诊断和治疗疾病的依据。如出现文中描述的症状，请及时就医。另外，本文仅节选原文的一部分，内容可能不完整或与原文存在偏差，若需更完整的信息请参阅原文。