上海
铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）是临床中最常见的高风险耐药细菌之一，能够在囊性纤维化（Cystic fibrosis，CF）患者和其他免疫系统功能低下患者体内定植并造成多种类型的急性或慢性感染，具有易感染、易变异和多耐药的特点。据统计在2019年全球有55.9万例死亡病例与铜绿假单胞菌感染相关，目前世界卫生组织已将该菌列入新型抗生素研发重点病原体清单。
铜绿假单胞菌侵入人体肺部时主要黏附于肺上皮细胞，在这一过程中细菌的营养获取途径和毒力代谢将受到显著影响，及时感知宿主环境变化并获取碳源物质是铜绿假单胞菌成功定植的关键。磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，PC）是肺细胞表面脂质的主要成分，研究显示铜绿假单胞菌将磷脂酰胆碱分解为胆碱（Choline，Cho）、甘油和长链脂肪酸后转运至胞内，维持自身的高密度生长、毒力因子合成及耐药基因表达。在这些宿主来源的小分子中胆碱被认为是铜绿假单胞菌的主要营养物质之一，转录组分析证明铜绿假单胞菌生长于CF患者痰液培养基中时上调了相当数目的胆碱转运及代谢基因，而敲除这些基因显著降低了铜绿假单胞菌在小鼠肺部的定植率。此外，胆碱也能作为信号分子诱导毒力因子溶血性磷脂酶基因的表达以及铜绿假单胞菌的胁迫抗性。因此，外源胆碱分子在细菌的适应性感染中发挥双重作用，但具体的信号转导机制尚待阐明。
近日，来自四川大学生物治疗国家重点实验的包锐教授和四川师范大学生命科学学院的宋英杰副教授团队合作在Science Advance杂志上发表文章
A choline-sensing regulator coordinates metabolic adaptation and pathogenesis in Pseudomonas aeruginosa pulmonary infections，通过 生物信息学分析及敲除验证，从铜绿假单胞菌基因组中鉴定了一个未知的转录调控因子，能够直接识别胆碱，从而调控细菌胆碱代谢、毒力因子、抗生素耐药性基因的表达，并将其命名为CodR（ Choline-induced regulator ）。研究证明 CodR 可感知宿主肺部来源的胆碱 分子来激活细菌对外源胆碱的摄取和代谢，细菌 侵染 能力和耐药性也随之增强，这为阐释胆碱分子驱动的铜绿假单胞菌代谢适应和毒力调控提供了新维度。
参与细菌胆碱分解代谢的基因簇的转录调控主要由邻近的调控蛋白介导，例如铜绿假单胞菌的GbdR和枯草芽孢杆菌的GbsR/OpcR调控因子。作者分析铜绿假单胞菌参考菌株UCBPP-PA14和PAO1基因组后共发现至少七个Cho相关基因簇，其中一个未知的调控因子（codR）位于胆碱转运膜蛋白基因betT2和磷酸胆碱磷酸酶基因pchP上游。EMSA实验证实CodR能够结合自身的启动子区域并调控pchP及其它相邻基因的表达。β-galactosidase报告实验显示敲除codR显著降低了pchp等基因的表达，提示CodR的功能可能与胆碱代谢相关。此外，ΔcodR菌株在磷脂酰胆碱为碳源的培养基中的生长也受到显著影响。
系统发育树分析显示CodR属于GcvA亚家族，该家族蛋白被报道主要感应甘氨酸类分子并调控氨基酸代谢。考虑到胆碱分子在铜绿假单胞菌中经过数步代谢后转变为甘氨酸，两者的分子结构存在相似之处。因此，作者推测胆碱可能作为CodR的配体并调控其转录活性。微量热泳动实验（MST）证明CodR与胆碱的亲和力达到了1.27 ± 0.19 μM，而对其代谢衍生物的亲和力极低。胆碱增强了CodR对DNA的结合能力，但并不影响CodR的聚合状态，这一机制与其它GcvA蛋白吻合。转录分析表明外源添加胆碱激活了codR及相邻基因的表达，敲除codR后则失去了激活作用，再次印证了CodR在胆碱信号转导通路中扮演枢纽角色。为了探究CodR对胆碱的识别机制，研究人员基于AlphaFold3，CB dock，和AutoDock vina等多个软件开展了分子对接实验，结合位点突变和报告系统证明P99, S100, T101, W129, R198, T223, L224等多个残基负责特异性识别胆碱。
蛋白组学分析显示，在外源添加胆碱培养基中敲除株显著下调了多个通路的蛋白表达，包括III型分泌系统（T3SS）成分（ExsE、ExsC、ExoU、Pcr3、PopB、PscB、HcpA、PscL）、群体感应（QS）调节因子和铁载体合成相关蛋白。此外，对生物膜形成和抗生素外排泵，如MexG、MexH、MexI和OpmD，均显著降低。磷酸胆碱磷酸酶PchP的表达也受到了抑制作用。而在LB及添加胆碱分解产物甜菜碱的培养基中，除了抗生素毒力外排泵外相关蛋白的表达并未观测到明显变化。这些发现证明了CodR-胆碱信号通路在调控铜绿假单胞菌毒力中的特殊作用。进一步研究证实CodR可以特异性识别mexA、pslA和amrZ等基因启动子序列，从而调控细菌耐药、生物膜合成和毒力因子表达，这些发现与组学数据相吻合。
紧接着，作者探究了CodR在细菌毒力因子表达，生物膜合成和耐药中的作用。体外转录分析显示与野生型（WT）相比，ΔcodR菌株中这些基因的表达水平显著降低。有趣的是，额外补充磷脂酰胆碱或者胆碱能够一定程度上缓解这一缺陷，但仍未达到WT水平。在磷脂酰胆碱及胆碱刺激下，WT的生物膜合成量提高了1.51-1.84倍，对美罗培南和环丙沙星的抗性明显增强，而在敲除株中没有观察到此现象。此外，作者利用c57bl/6小鼠肺部感染模型探究CodR在铜绿假单胞菌感染和定植中的作用。WT组的小鼠在感染后40 h的死亡率约为42%，感染72 h后的死亡率为75%。相比之下，感染敲除株的小鼠死亡率更低，并导感染72 h后的仍保持52%的存活率。肺部细菌负荷分析显示，感染24 h后WT和ΔcodR菌株的小鼠肺部细菌负荷分别为log10 2.9和log10 2.2。而在感染48h后，ΔcodR组相比WT的肺部细菌负荷降低了12.5倍。组织病理学评估（HE）进一步证实敲除组的小鼠肺泡结构完整性更高，中性粒细胞浸润减少。支气管肺泡灌洗液（BALF）定量分析显示，ΔcodR组小鼠的炎症反应水平相比WT更低。重要的是，在WT小鼠的BALF中检测到了水平更高的磷脂酰胆碱，而其它类型的磷脂化合物如磷脂酰肌醇或磷脂酰丝氨酸没有差异，充分说明CodR在铜绿假单胞菌摄取磷脂酰胆碱以及适应性感染中发挥重要作用。
总的来说，这些研究通过生物信息学及分子生物学手段，鉴定发现了一个新型胆碱识别调控因子CodR，揭示了CodR-胆碱信号轴在铜绿假单胞菌肺部适应性感染和耐药中的新机制，为后续开发靶向小分子药物提供了重要依据。
华西医院感染性疾病中心/生物治疗全国重点实验室包锐课题组长期从事病原微生物对宿主侵染及耐药机制的研究，同时也涉及抗菌药物新靶点的发现与验证及细菌疫苗等新型生物药的研发，相关成果在Nature Chemical Biology, Science Advance，Nucleic Acids Research（2022，2024）, ACS Catalysis, PNAS, PLoS Pathogens（2022，2024）, mBio等学术期刊上发表研究论文50多篇，承担和完成了多项国家重大科技项目和自然科学基金项目。目前向外招聘博士后和科研助理，需求方向包含生物信息学、计算机科学、生物统计学或计算生物学、生物化学与生物物理学、生物组学（蛋白组，基因组及代谢组学）、遗传学或细胞生物学、结构生物学、微生物学或临床病原微生物学等相关方向或相近方向。待遇从优，具体管理按照四川大学华西医院相关规定执行，欢迎沟通交流。
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adz1415
制版人： 十一
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