同样的操作，为什么师兄的细胞周期这么稳（FlowJo 的 6 步攻略）

关注生物学霸，每周更新科研干货哦

拟合不佳、峰位偏移、CV 值总爆表？为什么你做的细胞周期总是不稳定？先看解决办法，再看常规操作。

常见问题与解决方案

1. 峰位偏移或峰宽异常：在进行细胞周期拟合时，经常出现拟合曲线与实测直方图匹配度差的情况，细胞周期拟合准确度不佳。这种情况在分析经化疗药物处理的肿瘤细胞样本时尤为常见。

主要原因：

（1）样本质量问题：存在亚二倍体细胞（凋亡碎片）或四倍体以上细胞

（2）制备工艺缺陷：DNA 染色不均匀或细胞团块未被充分分散

（3）仪器参数设置不当：电压或增益设置不准确

解决方案：

（1）优化样本前处理流程：采用梯度离心法去除细胞碎片；确保 PI 染色浓度和时间标准化；使用 35μm 滤膜过滤消除细胞团块。

（2）改进数据分析方法：

a. 建立多层次设门策略：

初级设门：FSC-A/SSC-A 散点图中设置「凋亡细胞门」

次级设门：PI-A/PI-W 散点图中排除双联体

高级设门：针对 G2/M 峰后异常高 DNA 含量群体设置专门排除门

b. 采用多模型拟合方法，对比 Dean-Jett-Fox 模型和 Watson 模型的拟合效果

2. 出现异常中间峰：在 FSC-A/FSC-H 散点图中难以准确区分单细胞与细胞双联体

影响因素：

（1）细胞样本的均一性

（2）上样浓度控制

（3）仪器液流稳定性

（4）细胞本身特性

解决方案：

（1）建立多参数联合设门方案

a. 主要设门参数：PI-A/PI-W 散点图，利用双联体在 PI-W 方向的双峰分布特征

b. 辅助设门参数：SSC-W/SSC-H 散点图，从细胞复杂度角度进一步筛选

c. 多级设门流程：FSC-A/SSC-A →「Cells」排除碎片）

FSC-A/FSC-H → 「Single Cells」（排除粘连体）

（2）优化实验条件

a. 控制细胞浓度为 1×10^6/mL

b. 确保样本充分混匀

c. 使用标准微球校准仪器

3. 分析结果重复性差：相同样本在不同型号流式细胞仪上获得的分析结果存在显著差异，影响数据的可比性和可重复性。

仪器特异性配置方案：

（1）BD 仪器优化设置：

检测通道：FL2-A（面积信号）用于 DNA 含量分析

双联体排除：FL2-W（宽度信号）与 FL2-A 组合使用

电压配置：FL2-A 采用线性放大，调节电压使 G0/G1 峰位于道数 200±10 范围内

（2）Beckman 仪器配置方案：

检测通道：FL3-LIN（线性信号）

双联体识别：FL3-PEAK（峰值信号）

增益设置：根据标准样品进行优化校准

（3）标准化措施：

建立跨仪器校准标准操作程序

使用统一的标准微球进行日常质控

定期进行仪器间比对测试

4. 特殊样本分析策略：

异倍体细胞分析：出现异常 DNA 含量峰，标准单峰模型无法有效拟合。

解决方案：

（1）采用多峰拟合策略；选择「Multi-Cycle」分析模式；手动设置参考峰位置；分别拟合不同倍体细胞群体；使用已知 DNA 含量的标准细胞作为参照。

（2）建立异倍体细胞分析标准：确定主要峰位的 DNA 指数；设置合理的拟合边界条件；验证拟合结果的生物学合理性。

5. 数据质量保证体系：不同批次或不同操作者之间的分析结果存在较大差异。

质量控制标准：

（1）关键参数监控范围：

G0/G1 峰 CV 值：<8%

G2/G1 比例：1.95-2.05

细胞碎片比例：<10%

通过 FSC-A/FSC-H 设门后，「Single Cells」门内的细胞数应占「Cells」门总细胞数的 >95%。

（2）标准化参考体系：

批次质控：每批次实验包含标准二倍体细胞对照

商业标准品：定期使用 BD CV Calibrator 等标准品验证

内部标准：建立实验室特有的参考细胞系和标准范围

6. 数据分析问题

问题现象

可能原因

解决方案

G0/G1 峰CV>10%

染色不均/仪器失调

优化染色程序/仪器校准

无 G2/M 峰

细胞增殖受阻

检查培养条件/设立阳性对照

出现 >4N 峰

多倍体/细胞团块

加强过滤/使用 PI-W 排除双联体

拟合失败

模型选择不当

手动调整参数

软件操作全流程

1. 启动软件：双击 FlowJo 图标进入工作台，界面包含菜单栏、工具栏、样本空间。

2. 导入数据：将.fcs 文件拖入组空间，或通过菜单栏「File」→「Import」选择文件。支持批量导入多个样本。

3. 去除碎片：

3.1 双击样本打开图形窗口，X 轴选 FSC-A（前向散射），Y 轴选 SSC-A（侧向散射），坐标轴设为线性。

3.2 用矩形门或多边形门圈出主细胞群，将此门命名为「Cell」，点击 ok 后，排除左下角碎片。

3.3 圈定单细胞群体：

双击主细胞群进入新窗口，单细胞沿着对角线分布粘连体偏离对角线，分布在右上区域，沿对角线圈定细胞群体，命名为「Single Cells」。

4. 分析结果：

4.1 返回主界面，右键 single cells，选择「Platforms」→「Cell Cycle」。

4.2 进入结果分析界面，选择正确的 DNA 通道（如 PE-A，具体取决于您的仪器配置和染料），软件会自动使用 Dean-Jett-Fox 模型进行初次拟合，然后就得到了彩色的周期图。

4.3 优化拟合参数（如需要）：

调整 G2/G1 比例（通常为 2.0）；微调 G0/G1 和 G2/M 峰的 CV 值（变异系数）

结果解读与导出

1. 查看分析结果：

• 周期比例：窗口显示 G0/G1%、S%、G2/M% 及 G1/G2 平均荧光强度。

• 图形输出：直方图中粉色曲线为拟合模型，黑色为原始数据，重叠度反映拟合质量。

• 批量分析：在 FlowJo 主界面，选中已完成细胞周期分析的样本中的「Single Cells」门，然后右键选择「Copy」。再选中其他需要应用相同分析的样本，右键选择「Paste」。这样可将完整的分析流程（包括细胞周期分析）应用到其他样本。

2. 数据导出：

• 图片导出：点击「Layout Editor」排版，支持 JPG、PNG、PDF 格式。

• 表格导出：点击「Table Editor」生成统计表，包含周期比例、RMS 值等参数。

3. 工作流保存：通过「File」→「Save Workspace As」保存.wsp 文件，便于后续修改。

编辑：冷漠小 z

题图来源：图虫创意