北京
低温肉制品是指在加工温度低于100 ℃，并在0～4 ℃条件下进行成品运输、贮藏、销售的一类肉制品，主要包括熟肉制品、鲜肉制品、预调理制品等。低温肉制品因其高营养、高水分特性极易污染微生物，导致肉制品腐败，产品货架期缩短。低温肉制品货架期的延长一直是食品领域需要解决的问题。
生物保护菌是指能够添加到食品中，可以延长食品保质期和抑制有害微生物繁殖的活微生物。现阶段，用于生物保护的菌种大多为乳酸菌。乳酸菌能通过合成有机酸、细菌素和环肽等多种抑菌代谢物以及竞争作用抑制其他细菌的生长。在肉制品中，乳酸菌还能够提高肉制品感官质量，赋予肉制品特有的色泽和风味，减少生物胺和亚硝酸盐的含量，提高产品的安全性。生物保护菌现已逐渐被应用在肉及肉制品的防腐中，用于抑制包括假单胞菌、索丝菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等常见肉类腐败菌和致病菌的生长繁殖。
虽然生物保护菌抑制肉类腐败的研究在逐渐增加，但具有生物保护潜力的菌种依然较少，有待进一步发掘。
东北农业大学食品学院的杜文静、王强、孔保华*等在前期工作基础上进一步筛选耐低温乳酸菌，深入研究其在低温环境下的适应性及对4 种肉中常见腐败指示菌的抑菌能力，以期增加耐低温乳酸菌的应用领域，为耐低温生物保护菌的开发提供新的策略，为低温肉制品中腐败菌的靶向抑制提供理论参考。
1 低温条件下乳酸菌生长能力的分析
乳酸菌的生长和代谢受环境温度的影响较大，在不同的环境温度下生长繁殖情况有所差异。乳酸菌的最适生长温度通常在25～37 ℃。然而在低温环境下，部分乳酸菌仍能展现出较强的生长能力和适应性。如图1所示，4 ℃时菌株整体生长趋势缓慢，P.acidilacticiL1在第6天时的OD600nm达到最大，为0.263。7 ℃时P.acidilacticiL1与L.plantarumHG1-1增长速度较快，第10天时OD600nm分别升至1.073与0.967。10～20 ℃条件下，P.acidilacticiL1与L.plantarumHG1-1进入指数增长期后迅速增殖，其中10 ℃的OD600nm分别达2.215与2.146，高于其他菌株。在4～10 ℃的温度条件下，P.acidilacticiL1与L.plantarumHG1-1稳步增长，生长能力强于其他菌株，生长状况较佳，故筛选P.acidilacticiL1和L.plantarum HG1-1作为后续实验的耐低温菌株。
2 耐低温乳酸菌低温适应性分析
2.1 SOD活力
SOD是一种酸性蛋白酶，具有良好的热稳定性和生物保护功能，可以有效清除超氧阴离子并将其催化为H2O2。极端条件下，生物体会提高SOD活力以适应环境。如图2A所示，在7 ℃恒温培养条件下，3 株菌的SOD活力的趋势随着培养时间的延长逐渐增大，均在72 h达到峰值，P. acidilactici L1、L. plantarum HG1-1、L. sakei B2的SOD活力分别为36.58、32.85、22.12 U/mg，随后逐渐降低。P. acidilactici L1和L. plantarum HG1-1在整个培养过程中SOD活力均显著高于L. sakei B2（P＜0.05）。这可能是在低温环境下，P. acidilactici L1和L. plantarum HG1-1菌体内自由基浓度上升，2 种菌能够更好地通过提高SOD活力维持身体内氧自由基的平衡，清除生物体内有氧代谢产生的超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。
2.2 蛋白酶活力
蛋白酶在微生物的生理代谢过程中起着关键作用，对于嗜冷菌来说，其蛋白酶通常在低温条件下具有较高的活性，能够在低温环境中有效催化蛋白质的水解等代谢反应，从而保证微生物在低温条件下的正常生长和代谢活动。一般来说，低温条件下细菌的蛋白酶活力越高，在一定程度上说明该细菌对低温的适应性较好。如图2B所示，3 株菌胞外代谢物的蛋白酶活力均随培养温度升高而增大，并在25 ℃时达到最高，P. acidilactici L1、L. plantarum HG1-1和L. sakei B2的蛋白酶活力分别为56.58、48.12、30.85 U/mL，随后逐渐降低。4 ℃时P.acidilactici L1和L. plantarum HG1-1的蛋白酶活力分别为8.92 U/mL和7.56 U/mL，显著高于L. sakei B2的4.55 U/mL（P＜0.05）。在其他培养温度时，P. acidilactici L1和L. plantarum HG1-1的蛋白酶活力也均显著高于L. sakei B2。这一结果也表明P. acidilactici L1和L. plantarum HG1-1具有更好的低温适应性，在低温环境下仍能保持一定的生理活性和代谢能力。丁宁等也发现了类似的结果，他们从谷物中筛选的乳酸片球菌和戊糖片球菌也能分泌耐低温蛋白酶，其具有很好的低温适应性。
2.3 扫描电镜分析
如图3所示，在25 ℃培养条件下，3 株菌菌体均光滑饱满、形态完整。在7 ℃培养条件下，P. acidilactici L1与L. plantarum HG1-1菌体表面光滑饱满，形态相对完整，而L. sakei B2菌体膨胀破裂发生变形。在4 ℃条件下，P. acidilactici L1与L. plantarum HG1-1菌体发生黏连，部分产生形变，这可能是因为其细胞膜的脂类含量增加，脂肪酸比例发生变化所致，而L. sakei B2菌体发生严重变形并膨胀破裂，这可能是因为L. sakei B2无法适应低温环境。
2 耐低温乳酸菌低温适应性分析
3.1
P. acidilacticiL1、
L. plantarumHG1-1和
L. sakeiB2的抑菌能力
乳酸菌在代谢过程中能生成多种抑菌物质，包括有机酸、细菌素及环肽等，可以有效抑制多数有害微生物的生长。如图4A所示，P. acidilactici L1与L. plantarum HG1-1胞外代谢产物对A. baumannii、S. epidermidis及B. thermosphacta的抑菌效果明显。类似地，杜贺超等发现植物乳植杆菌163可以破坏B. thermosphacta的细胞膜和内部结构，发挥抗菌活性。而L. sakei B2的胞外代谢产物抑菌能力较弱。整体来说，3 株菌对A. salmonicida的抑菌效果均较弱。
3.2
P. acidilacticiL1、
L. plantarumHG1-1和
L. sakeiB2发酵液不同稀释倍数的抑菌性
如图4B所示，对于A. salmonicida，P.acidilactici L1与L.plantarum HG1-1发酵液在未稀释时抑菌圈明显，具有较好的抑菌性，而稀释1 倍和2 倍后抑菌性极弱，接近最低抑菌浓度；而L.sakei B2在任何稀释倍数下均未对A.salmonicida表现出抑菌性。P.acidilactici L1和 L.plantarum HG1-1的发酵液随稀释倍数的增加对A.baumannii的抑菌圈显著减小，但稀释2 倍时仍存在；而L.sakei B2稀释后对A.baumannii的抑菌效果几乎消失。P.acidilactici L1和L.plantarum HG1-1对S.epidermidis均具有显著抑菌性，稀释后仍具有较好的抑菌能力。L.sakei B2对S.epidermidis几乎无作用。与未稀释发酵液抑菌圈直径相比，随稀释倍数增加，3 种菌株对B.thermosphacta的抑菌圈直径均减小。综上，P.acidilactici L1和L.plantarum HG1-1对肉中常见的腐败菌具有较好的抑菌潜力。
4 耐低温乳酸菌胞外代谢产物的抑菌性
4.1
P. acidilacticiL1、
L. plantarumHG1-1和
L. sakeiB2胞外代谢产物经加热处理后的抑菌效果
乳酸菌已被证明能起到抑制腐败菌生长的作用，如产生具有抗菌活性的化合物，如脂肪酸、有机酸、环二肽等，其中对温度更为敏感的是蛋白类物质。如图5A、B所示，P.acidilactici L1胞外代谢产物未经热处理组的抑菌性最佳，整体随热处理温度（45～85 ℃）的升高而有所减弱。其胞外代谢产物在未加热条件下与85 ℃处理相比，对A.salmonicida、A.baumannii、S.epidermidis、B.thermosphacta的抑菌圈直径分别从19.26、13.22、17.54、19.95 mm下降至14.08、9.98、13.06 mm和14.57 mm。同样，如图5A、C所示，L.plantarum HG1-1胞外代谢产物经45 ℃热处理后的抑菌性最佳，整体随热处理温度（45～85 ℃）的升高而有所减弱。其胞外代谢产物在经45 ℃热处理后与85 ℃处理相比，对A.salmonicida、A.baumannii、S.epidermidis、B.thermosphacta的抑菌圈直径分别从27.30、21.26、25.52、22.65 mm下降至20.16、14.86、21.08、17.80 mm。P.acidilactici L1的抑菌圈直径较大，P.acidilactici L1的抑菌效果整体优于L.plantarum HG1-1。由图5A、D可知，对照菌株L.sakei B2胞外代谢产物对A.salmonicida、A.baumannii、S.epidermidis、B.thermosphacta的抑菌圈直径整体也呈现出随热处理温度升高而下降的趋势，但与P.acidilactici L1和L.plantarum HG1-1相比，抑菌圈整体偏小，抑菌性较低。此外，经85 ℃热处理后的P.acidilactici L1和L.plantarum HG1-1的胞外代谢物对4 种腐败菌仍具有一定的抑菌活性，表明代谢物中的抑菌物除蛋白类外，还具有热稳定性较强的非蛋白类抑菌物质。胡美丽研究发现经过60、80、100 ℃处理30 min以及121 ℃处理15 min后，产细菌素乳酸菌的抑菌活性下降，但仍有抑菌效果，这与本实验结果相似。可能是由于加热处理导致了具有抑菌活性的蛋白质发生变性。严梦涵等也发现，将植物乳酸菌素PlnJ在100 ℃加热30 min，其对大肠杆菌仍具有抑菌效果。
4.2
P. acidilacticiL1、
L. plantarumHG1-1和
L. sakeiB2胞外代谢产物经酶处理后的抑菌效果
乳酸菌在发酵过程中生成的生物活性蛋白类细菌素能有效抑制腐败菌。基本上所有的细菌素都可以被一种或几种蛋白酶水解而丧失活性，这也成为鉴定细菌素的重要指标之一。如图6所示，P.acidilactici L1、L.plantarum HG1-1和L.sakei B2胞外代谢产物经胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶处理后，对4 种指示菌仍具抑菌活性，但抑菌圈直径均显著减小（P＜0.05）。其中，P.acidilactici L1和L.plantarum HG1-1的胞外代谢产物对胰蛋白酶处理最为敏感，P.acidilactici L1组经胰蛋白酶处理后对A.salmonicida、A.baumannii、S.epidermidis、B.thermosphacta的抑菌圈直径分别从22.12、23.59、21.51、19.52 mm下降至16.89、13.31、10.61、12.16 mm（P＜0.05）。L.plantarum HG1-1组经胰蛋白酶处理后对A.salmonicida、A.baumannii、S.epidermidis、B.thermosphacta的抑菌圈直径分别从28.51、26.68、22.31、23.57 mm下降至17.93、16.27、10.35、15.32 mm（P＜0.05），这说明P.acidilactici L1和L.plantarum HG1-1产生的具有抑菌活性的细菌素多具有精氨酸和赖氨酸羧基端肽键，易受胰蛋白酶水解。苏帆帆等也发现乳杆菌KC4经过胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等处理后抑菌效果极显著降低（P＜0.01），这与本实验结果类似。
4.3
P. acidilacticiL1、
L. plantarumHG1-1和
L. sakeiB2胞外代谢产物经调节pH值处理后的抑菌效果
乳酸菌在酸性和中性条件下能够保持较好的抑菌活性，在碱性条件下其活性往往就会受到较大影响。如图7所示，随着pH值升高，P. acidilactici L1、L. plantarum HG1-1和L. sakei B2胞外代谢产物的抑菌圈直径均显著减小（P＜0.05）。在pH 7.0时，3 株菌胞外代谢产物的抑菌活性均消失。因此，P. acidilactici L1、L. plantarum HG1-1和L. sakei B2胞外代谢产物的抑菌活性均受pH值的调控，在酸性环境下抑菌效果更佳。
3 结论
本研究筛选出了2 株在低温条件具有生物保护潜力的菌株P. acidilactici L1和L. plantarum HG1-1。2 种菌具有较高的SOD活力和蛋白酶活力以适应低温环境，在低温条件下培养其菌体形态优于商业保护菌L. sakei B2。这2 种菌对3 种低温肉制品中常见腐败菌A. baumannii、S. epidermidis和B. thermosphacta均具有显著抑制作用。P. acidilactici L1和L. plantarum HG1-1胞外代谢产物经85 ℃热处理后对低温肉制品中常见腐败菌仍具有抑菌活性，且抑菌活性对蛋白酶处理敏感，说明抑菌物质既有蛋白类，也有热稳定的非蛋白类物质。此外，P. acidilactici L1和L. plantarum HG1-1胞外代谢产物对低温肉制品中常见腐败菌的抑菌活性随pH值升高而降低，pH 7.0时几乎无抑菌性，说明其抑菌作用与菌株产生的有机酸有关。P. acidilactici L1的抑菌效果整体优于L. plantarum HG1-1。本研究揭示了P. acidilactici L1和L. plantarum HG1-1菌株的低温适应性及对低温肉制品中常见腐败菌的抑菌特性，为肉制品保鲜提供了潜在菌株。
本文《 具有生物保护潜力的耐低温乳酸菌筛选及其抑菌特性 》来源于《食品科学》2025年46卷第9期121-129页，作者： 杜文静，王强，陈倩，刘骞，孔保华 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20241031-196 。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。
实习编辑：安宏琳；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网
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