《食品科学》：中国肉类食品综合研究中心任南工程师等：高效液相色谱法测定肉制品中多种游离核苷酸

肉品中含有丰富的呈味核苷酸，不仅对肉品风味感知的厚度和复杂性具有重要贡献，还可以评价肉制品品质。肉制品中的游离核苷酸主要来源是肉制品内源物和人为添加。在肉制品中对风味产生影响主要作用的核苷酸有腺苷酸（AMP）、肌苷酸（IMP）、鸟苷酸（GMP）、次黄嘌呤核苷（HxR）、次黄嘌呤（Hx） 5 种，具体结构如图1所示。IMP、GMP、AMP本身就具有鲜味，并且会与谷氨酸钠之间呈现强烈地味的相乘作用，当谷氨酸钠和IMP或GMP混合时，所呈现的鲜味是谷氨酸钠单独呈现鲜味的数倍，Hx具有苦味，会给肉的整体风味带来负面作用，5 种核苷酸的组成和相互作用形成了肉制品的不同风味。

中国肉类食品综合研究中心的纪晓萌、王真、任南*等采用高效液相色谱法对肉制品中IMP、GMP、AMP、Hx、HxR进行检测；拟对提取溶剂、溶液pH值、色谱柱的选择、流动相比例和柱温等条件进行优化，旨在建立操作简便、定量准确、重现性好的检测方法，实现对复杂肉制品基质的检测分析，以期为企业在生产环节中核苷酸含量的监测提供方法，使消费者更了解肉品品质的量化指标，同时也为完善我国肉制品品质的标准体系、建立国家标准提供强有力的技术支持。

1 仪器条件的优化

1.1 检测波长的确定

参考有关文献，运用光电二级阵列管检测器，对5 种核苷酸进行扫描得到光谱图，发现HxR、IMP在248 nm处有最大吸收，GMP在254 nm处有最大吸收，AMP在259 nm处有最大吸收，Hx在250 nm处有最大吸收。将色谱图叠加得到图2，在254 nm波长处，AMP、HxR光谱形成交叉点，Hx、IMP光谱形成交叉点，并且都具有较高的响应，同时GMP在此波长下响应值也较高，所以最终实验确定选用检测波长为254 nm。在该波长下，5 种核苷酸的响应均可以满足方法检出限（LOD）和定量限（LOQ）的要求。

1.2 色谱条件的确定

选择合适的色谱条件，保证5 种核苷酸的色谱峰可以实现基线分离是进行研究的第一步。在色谱柱和流动相选择上，比较C18柱、Hilic Plus柱、SB-Aq柱3 种色谱柱，同时选取水/甲醇、甲酸水/甲醇、磷酸二氢钾/甲醇、乙酸铵/甲醇的流动相体系，在等度洗脱条件下进行分离。通过查阅文献可知，在5 种核苷酸中，GMP和IMP较为难分离。结果发现，无论在何种流动相条件下，Hilic Plus柱、SB-Aq柱均无法将GMP和IMP分离（图3A、B）。C18柱在磷酸二氢钾/甲醇流动相体系下，可以成功分离5 种核苷酸。最终确定色谱柱为C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.01 mol/L磷酸二氢钾∶甲醇＝98∶2（V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：20 μL。HxR、IMP、GMP、AMP、Hx（10 μg/mL）标准溶液的色谱图见图3C。

1.3 柱温的确定

调节柱温箱的温度，观察不同柱温下色谱峰的出峰时间和分离度的变化。分别考察了柱温为25、30、35 ℃的5 种核苷酸的出峰情况，结果如图4所示。结果表明，5 种核苷酸的出峰时间在25 ℃及30 ℃条件下，出峰时间变化较小；35 ℃条件下，5 种核苷酸的出峰时间后移，并且峰面积变小；不同温度对于5 种核苷酸的分离度影响较小。考虑到实验室通常的仪器配置及检测的环境温度，因此选择柱温为25 ℃。

2 前处理条件的优化

2.1 提取溶剂的确定

作为化合物分析的第1步，选择合适的提取溶剂，将目标物从样品基质中高效、快速地提取出来，直接影响方法的提取效率和后续的净化步骤。本实验选择5%高氯酸＋5%甲醇、5%高氯酸、5%三氯乙酸、100%乙腈作为提取溶剂，分别考察4 种溶剂的提取效果。由于样品基质本身含有目标化合物，采用基质曲线排除基质中所含有目标物对实验结果造成的影响。

对比加标量为100 mg/kg时的加标回收率。由图5可知，用100%乙腈作提取溶剂时，5 种核苷酸基本没有回收，说明核苷酸很难溶解于有机溶剂，从而影响提取效率。用5%三氯乙酸溶液作提取溶剂时，目标化合物的加标回收率在52%左右。用5%高氯酸溶液和5%高氯酸＋5%甲醇溶液作提取溶剂时，目标化合物的加标回收率在65%左右，但甲醇的加入会使实验平行性变差，实验偏差过大。因此选用高氯酸溶液作为提取溶剂。

进一步对提取溶剂的体积分数进行优化。选择不同体积分数的高氯酸（1%、5%、10%、15%），分别考察其提取效果。对比加标量为100 mg/kg时的加标回收率，实验结果如图6所示。结果表明，当高氯酸的体积分数为1%时，回收率为40%左右；当高氯酸体积分数为15%，回收率为53%左右，但结果偏差较大；当高氯酸体积分数为5%、10%时，回收率约为64%。两者回收率没有明显差异，考虑到酸会对后续处理产生影响，因此选择体积分数较低的5%高氯酸溶液作为提取溶剂。

2.2 提取方式的确定

肉制品中脂肪和蛋白质的含量都很高，会对化合物的提取会有一定影响。选择合适的提取方式，有助于减小基质对于化合物的干扰，减少净化难度。本实验考察常见的4 种提取方式：室温超声30 min、冰浴超声30 min、常温振荡器振荡30 min、添加陶瓷均质子涡旋30 min。由于样品基质本身含有目标化合物，采用基质曲线排除基质中所含有目标物对实验结果造成的影响。

对比加标量为100 mg/kg时的加标回收率，实验结果如图7所示。室温超声30 min的回收率约为58%，冰浴超声30 min的回收率约为60%，两者没有明显差异。常温振荡器振荡30 min的回收率约为70%，添加陶瓷均质子涡旋30 min的回收率约为67%，两者在回收率上无明显差异。但添加陶瓷均质子涡旋30 min得到的提取溶液表面有较多油脂悬浮，会对后续操作产生干扰，对比照片见图8。因此在提取时选择常温振荡器振荡30 min。

进一步对振荡器振荡过程的提取时间进行优化。选择不同提取时间（10、20、30、40 min）考察其提取效果。对比加标量为100 mg/kg时的加标回收率，实验结果如图9所示。结果表明，在提取10 min后，回收率约为40%，且偏差较大，说明还未提取完全。随着提取时间的延长，回收率逐渐升高，从30 min到40 min时，回收率逐渐稳定在70%左右。因此选择提取时间为30 min。

2.3 提取液最终pH值的确定

在提取过程需要用到大量的酸保证游离核苷酸充分离子化，充分溶解。但提取液中酸会对后续操作产生干扰，也会影响色谱柱柱效，影响分析物保留时间和分离效果。因此，在定容之前需要对提取液的pH值进行调整。本实验比较不同pH值（5.5、6.0、6.5、7.0）提取溶剂的提取效果。由于样品基质本身含有目标化合物，采用基质曲线，以排除基质中所含有目标物对实验结果造成的影响。

对比加标量为100 mg/kg时的加标回收率，实验结果如图10所示。提取溶液pH值从5.5增加到6.5，回收率升高，提取溶液pH值从6.5增加到7.0，回收率降低，在pH 6.5时回收率最高。因此提取液pH值为6.5。

为了进一步锁定合适的pH值范围，对pH值进一步细化。本实验设置了几个不同的提取液pH值（6.1、6.3、6.5、6.7、6.9），探究其对回收率的影响，实验结果如图11所示。取溶液pH值从6.1增加到6.3时，回收率升高，pH值从6.3到增加6.7时，回收率随pH值的变化并不明显，提取溶液pH值从6.7到增加6.9时，回收率降低。因此，选取提取液pH值为6.5±0.2。

2.4 提取次数的确定

从之前的优化结果看，回收率约为70%，仍旧偏低，为了提高回收率，试图通过增加提取次数的方式提高回收率。如图12所示，提取1 次的回收率为73%左右，提取2 次的回收率约为95%，提取3 次的回收率约为96%，提取2 次和提取3 次的回收率没有明显差异。因此，实验采用2 次提取方式，实验回收率达到95%。

2.5 净化方式的确定

样品经过提取后，上清液中还含有大量油脂和蛋白质等杂质，杂质的分子质量较大，在流动相中流动缓慢，极易堵塞色谱柱，还会对目标物的检测产生基质干扰，降低方法的灵敏度。为了能有效对样品进行净化，除去油脂、蛋白质等基质干扰，需要选择合适的净化方式。本实验选择固相萃取法、液液萃取法2 种方式进行样品净化。经查阅文献，选择MCX柱、HLB柱、WAX柱、PSA柱等不同固相萃取柱类型。实验发现，由于5 种核苷酸的化学性质差异较大，没有一种固相萃取柱可以对5 种核苷酸均有较好保留。实验还验证了通过型PRIME HLB固相萃取柱，发现过柱后的提取液并未变得澄清，色谱图中杂质峰也未减少，而且会导致样品平行性变差。实验中还尝试了正己烷液液萃取法除去杂质。实验结果见图13，经正己烷净化后的提取溶液变更澄清，同时核苷酸的回收率没有减小。因此，净化方式采用正己烷液液萃取法。

3 方法学考察

3.1 标准曲线、LOD及LOQ

用优化好的色谱条件，用液相色谱测定系列标准工作液。以测得峰面积（Y）为纵坐标，对应的标准溶液质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，其回归方程和决定系数见表1。5 种核苷酸在0.5～80 μg/mL质量浓度范围内呈现良好的线性关系。

本方法选取猪肉脯、酱牛肉、腊肉、火腿肠、烧鸡作为代表样品，添加适量标准工作液进行实验，考察方法的LOD和LOQ。经回收率实验，当添加量为5 mg/kg时，信噪比（RSN）均大于3；当添加量为15 mg/kg时，RSN均大于10，色谱图见图14。所以本方法的LOD确定为5.0 mg/kg，LOQ确定为15.0 mg/kg。

3.2 稳定性考察

将配制的5 种核苷酸的储备液，并于4 ℃冰箱保存，分别在保存1、2、3、4、5、6 个月的时间点取样进行分析，记录化合物峰面积，按式（2）计算剩余分析物含量。由表2可知，储备液在3 个月之内响应值变化较小，表明标准储备液有效期定为3 个月可行。

将储备液稀释成质量浓度为100 μg/mL的混合标准工作液，并于4 ℃冰箱保存，按照0.5、1、1.5、2 个月的时间保存取样并进行分析，记录化合物峰面积。按式（2）计算剩余分析物含量。根据表3的数据变化可知，混合标准工作液在1 个月之内响应值变化较小。因此，混合标准工作液有效期定为1 个月可行。

3.3 方法的回收率

按照GB/T 19480—2009《肉与肉制品术语》中对肉制品的分类，结合日常生活中肉制品的食用频率，本实验选取猪肉脯、酱牛肉、腊肉、火腿肠、烧鸡作为代表样品，在样品中添加15、30、150 mg/kg（LOQ、2 LOQ、10 LOQ）的核苷酸进行回收率实验，重复进行3 次，实验色谱图见图15，实验数据见表4。实验得出15～150 mg/kg添加水平范围的回收率为80.1%～109.5%，相对标准偏差为 9.6%（n＝3）。

4 实际样品检测

从北京某连锁超市购买肉制品，选取了生活中经常食用的肉制品，取可食部分，经组织研磨仪研磨后，按照优化好的方法进行检测。实验数据见表5。15 个实际样品检测均检出IMP、Hx、AMP、HxR，部分样品未检出GMP，含量为19.5～816 mg/kg。5 种核苷酸中，IMP、Hx、HxR的含量较高，GMP的含量最低，实验结果与王永瑞、黎琪等的研究结果一致。

结 论

本研究建立了采用高效液相色谱仪同时测定肉制品中5 种游离核苷酸的检测方法，对仪器检测条件和前处理方法进行了优化，确定了检测波长，探究了流动相和色谱柱对待测物的影响，经过优化后，基线平稳，5 种游离核苷酸得到有效分离，进而对提取溶剂、提取方式、提取次数及净化方式等条件进行了优化，最终实现了同时对肉制品中5 种游离核苷酸的定量检测。另外用该方法对市售的15 个肉制品进行了检测，发现IMP、Hx、AMP、HxR均有检出，GMP部分检出，不同肉制品中核苷酸检出含量差异较大，在19.5～816 mg/kg之间。与目前测定相似基质的团体标准T/NAIA 003—2020《肌肉中肌苷、肌苷酸的测定 高效液相色谱法》对比，本研究中流动相为低浓度的磷酸盐，没有用到高浓度的三乙胺作为流动相，有效地保护了色谱柱；检测物质由2 种增加到5 种，检测物质更加全面；LOQ由0.5 g/kg降低到15.0 mg/kg，灵敏度更高；同时还增加了除脂净化等操作，对于仪器及色谱柱有更好的保护作用。综上所述，本方法操作简便、回收率稳定、重复性好，实用性强、利于广泛推广，不仅适用于肉制品风味评价，也可以为企业在生产环节中监测核苷酸提供方法，同时也为建立国家标准提供强有力的技术支持。

本文《高效液相色谱法测定肉制品中多种游离核苷酸》来源于《食品科学》2023年44卷第13期341-350页，作者：纪晓萌 ，王真，任南*，刘梦瑶，孔维恒，赵文涛，王江跃，刘鑫亿，郭文萍。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241209-060。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：栾文莉；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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