优化全动物体内成像中的检测

　　概述

　　动物研究对我们对人类疾病的理解做出了重大贡献，并作为治疗方法和其他治疗药物开发中既定且重要的步骤发挥作用。这些研究是在临床前阶段进行的，在人体临床试验中进行药物筛选之前。这些研究的目的是确定疗效、安全性、剂量和毒性，以及风险收益交易。在生命科学和化学分析中实施动物研究有许多既定的标准化方法。

　　生命科学实验分为三大类： 体外、离体和体内。体外测试研究生物体 之外的生物物质(细胞或组织)，实验通常在培养皿中使用。体外研究的好处是它们提供细胞和分子分析，同时开发细胞系以供未来研究使用。

　　然而，它最大的局限性是无法复制生物体的自然环境。为了解决这个问题，体外技术正在不断发展，例如类器官和器官芯片，它们在补充细胞培养和动物模型测试的能力方面显示出希望，在某些情况下甚至取代细胞培养和动物模型测试。

　　相比之下，离体用于研究从其他身体刺激中去除的特定器官和组织功能，在受控条件下进行。该过程的工作原理是在研究提取的感兴趣器官/组织时人为地模仿生物体外部的身体功能，如图1A所示。

　　图 1：正在测试的离体肺，由杜克大学离体器官实验室提供。(B)小鼠大脑内的大脑中动脉闭塞(MCAO)。图片由Artemis Intelligent Imaging提供

　　如果有证据表明实验策略在体外/离体实验中有效，则研究可能会进展到体内实验以收集更多信息和验证。体内实验采用完整的活生物体，而不是离体组织或体外对照的基于细胞的实验。

　　动物试验和临床试验是体内研究的两种形式。体内测试通常需要与体外测试一起进行，以观察实验过程对整个生物体的影响。小鼠、兔子、豚鼠和猴子(非人灵长类动物)是用于在临床前体内实验中评估潜在治疗方法的常见动物，如图1B所示。因此，体内成像对于确定关键生命科学研究的前进道路至关重要。

　　非侵入性 体内成像技术的进步使得动物模型能够在越来越多的临床前药物研发项目中得到有效使用。这些进步还使研究人员能够进行长期纵向实验，增加对动物模型的理解并缩短进行定量评估的时间。这还有一个进一步的优势，即减少完成体内研究所需的动物标本数量。

　　影像

　　有几种用于小动物体内成像的成像方式：光学成像 (OI)、磁共振成像 (MRI)、计算机断层扫描 (CT)、显微计算机断层扫描 (μCT)、单光子发射断层扫描 (SPECT)、扫描电子显微镜 (SEM)、超声 (US) 和正电子发射断层扫描 (PET)。

　　在很大程度上，这些不同的模式是互补的，而不是竞争性的。为了推广互补方法，一些供应商在同一台仪器中实施了多种模式，而其他供应商则提供了不同成像模式之间样品转移的便利性。例如，OI 和 μCT 成像的结合已在许多市售的体内成像系统中实施

　　光学成像

　　二十多年前，随着体内成像的引入，光学成像 (OI) 首次在临床前使用。OI 是有利的，因为它是非侵入性的，可以对动物进行实时成像。这使得该技术能够对药物疗效进行快速、纵向、准确、实时和定量的评估。

　　典型的小动物体内成像系统由一个“暗盒”组成，它包裹着相机、光学器件和动物受试者。在暗盒中成像的动物数量从单个受试者到多达十个不等。此外，暗盒内还有一系列配件，例如麻醉歧管和动物托盘，这些配件有助于实验设置。除了设备之外，还有系统电子设备，通常是摄像头冷却器，与主“暗箱”分开。

　　OI 是一种利用单个组织的光学散射特性差异来形成图像的技术。不同的 OI 成像技术提供有关动物结构、新陈代谢和生理学的补充信息。各个技术提供的信息可以通过图像配准机制协同，该机制结合了从每种技术获得的图像。

　　生物发光成像 (BLI) 和荧光成像 (FLI) 是 OI 中使用的主要成像技术。BLI 是酶促反应的结果，当一种波长的入射光被荧光探针吸收，然后以不同的(通常更长的)波长发射时，就会发生 FLI。这意味着FLI需要一个光源来激发荧光分子 (荧光团)，然后荧光分子发射光子以产生图像。相比之下，BLI使用昆虫、细菌和植物中天然存在的发光蛋白(荧光素酶)在体内进行细胞标记。

　　虽然没有直接转化为临床，但这些技术由于其易用性、灵活性、廉价性和快速图像采集的能力，已成为研究环境中小动物成像的主要资源。这些技术也是有利的，因为在组织培养中，在临床前研究之前开发的一些模型和测定可以直接转移到小动物体内。用于全动物分子 OI 的主要动物模型是小鼠，以“小鼠”研究为标准。大鼠成像也是可行的，同时通过浅表成像对大型动物(如兔子或非人类灵长类动物)进行研究。

　　由于更灵敏的相机、更强大的处理能力和数据存储容量以及更复杂的算法，光学成像作为一种模式已经取得了进步。与其他成像模式的关联变得更加简单，在某些情况下，通过使用通用设备或通过允许共同配准基准标记的仪器之间的穿梭机无缝衔接。这允许同时或随着时间的推移从同一动物那里获得互补数据。

　　生物组织内波长的相互作用

　　体内应用，尤其是那些使用荧光团的应用，必须考虑激发光源的特性，以防止不必要的组织损伤。例如，深蓝色或紫外线 (UV) 会导致组织创伤，而红外线 (IR) 中的激发会导致组织发热。

　　另一个问题是某些波长对组织的穿透性很差，可见的蓝/绿波长穿透深度低，限制了它们对非常小的动物或表面成像的使用[4]。除了这种考虑之外，动物体内的成分，如血红蛋白和相关分子，也会在可见的蓝/绿范围内自然发出荧光。这称为组织自发荧光。因此，由于足够的组织穿透力和低组织自发荧光，大多数常规荧光团的最佳激发波长在深红或近红外范围内，通常称为NIR-I窗口。下图 2 显示了基于光吸收和散射特性差异的光谱表征血液和组织。

　　图2：皮肤、脂肪、脱氧全血和含氧全血相对于波长的吸收系数。在称为“透明窗口”的 NIR-I 和 NIR-II 窗口内，含氧和脱氧血液的吸收减少。

　　由于每种组织类型的散射系数，不同的波长对组织的散射和穿透方式不同。生物组织内的散射程度 (μ (λ)) 由函数描述：μ 的 (λ)=al-ω

　　α与组织中散射中心的浓度以及周围介质的折射率与散射的折射率之间的比率有关。ω是波指数，与组织散射系数的行为有关，在生物组织中散射系数的行为通常在0.2~4之间，λ与入射光的波长有关。

　　因此，使用的波长越长，随着对组织的更深渗透，发生的散射就越少。NIR-I 窗口 (760-900 nm) 内的波长是有利的，因为它们与可见光范围不同，它们很难被组织内的水和血红蛋白吸收。这导致组织变得透明(因为它主要由水和血红蛋白组成)，从而可以在组织深处检测到近红外-I荧光团。然而，这些激发波长也会在生物组织内引起自发荧光，从而污染数据采集。NIR-II 波长范围内的体内成像具有更多优势。由于 NIR-II 波长窗口包含更长的波长 (1000-1700 nm)，因此生物组织内的散射较少。

　　尽管各种生物组织的吸收增加，但散射的减少和组织自发荧光的减少有助于比 NIR-I 成像更高的空间分辨率。这两个波长窗口都需要 HiRho CCD 传感器或 InGaAs 传感器，具体取决于所需的波长范围和分辨率。图3显示了多种成像方式以及它们能够在体内实现的成像参数。

　　图 3：用于体内光学成像的不同成像方式的特征参数。使用较长波长的方式能够更深入地渗透到组织中，但需要使用替代传感器来捕获图像。

　　成像参数和性能

　　有许多成像参数可以驱动有效的图像采集，主要是探测器灵敏度、空间和时间分辨率以及累积噪声。大多数高性能体内成像系统使用电荷耦合器件 (CCD) 或 InGaAs 二维阵列探测器，具体取决于发射信号的波长。这些参数的具体情况见表1。通常体内荧光团产生微弱的信号，由于需要更长时间的曝光，需要低噪声的检测器。因此，大多数体内成像系统采用深度冷却相机。

　　表1：InGaAs焦平面阵列传感器和硅CCD传感器的特性参数。

　　检测器灵敏度

　　灵敏度可以定义为系统的“光子捕获”能力。量子效率 (QE) 是系统将光子转换为电子的定量能力的函数，从而产生数字图像。系统 QE 通常被简化为仅描述相机探测器的 QE，但是探测器 QE 与光学器件和滤光片的传输相结合，将决定系统收集的信号的百分比。

　　灵敏度还受到发射光子波长的影响，每个探测器都有与特定波长范围相对应的最佳 QE。CCD 探测器的灵敏度在 350 至 1000 纳米 (nm) 之间，尽管标准硅 CCD 探测器的 QE 从 800 nm 大幅下降。典型的 CCD 探测器的峰值 QE 在中可见光范围内。

　　因此，大多数体内系统需要背面薄化或背面照明 (BSI) CCD。这种制造方法增加了光子的吸收，从而产生比正面照明 CCD 高得多的 QE。InGaAs 探测器通常覆盖 900 - 1700 nm 的波长范围，有些波长可达 2.5 微米。该范围称为短波红外线或 SWIR，并包含 NIR-II 窗口。如上所述，短波红外 (SWIR) 范围内的荧光成像引起了生物医学界的极大兴趣。

　　CCD和InGaAs探测器的典型QE如图4所示。用高电阻率块状硅(HiRho)制造的探测器在近红外中具有更高的QE，并且在图像中产生的条纹图案较少。条纹是由单色光在CCD传感器内反射时的相长干涉引起的。这些探测器提供 900-1050 nm 的成像能力，在 CCD 和 InGaAs 的有限性能范围内。该灵敏度对应于NIR-I窗口。InGaAs 探测器在 1000 nm 至 1600 nm 范围内具有非常一致的 QE。

　　图4：CCD 传感器、HiRho CCD 传感器和 InGaAs 传感器的典型量子效率曲线。

　　空间分辨率

　　空间分辨率是传感器可以解析的最小对象。样品结构和发射强度决定了精确数据采集所需的空间分辨率，传感器尺寸也是一个因素。传感器尺寸和光学器件很重要，因为它们可以确定视场和从样品中收集的总信号。这些参数受到相机和光学器件的性能、经济性和当前可用性的影响。像素数也是一个因素，因为它通常会决定特征分辨率。较小的像素允许更高的分辨率，但代价是动态范围较低，因为它们在给定噪声水平下收集的信号比较大的像素少。解决这一限制的一种方法是通过 像素合并 ，其中来自多个像素的信号被累积添加到单个像素中。这会提高灵敏度，但会降低分辨率。

　　探测器可以具有广泛的分辨率范围。以CCD探测器为例，空间分辨率可以从320 x 240到16百万像素。在光学体内系统中，典型的 CCD 格式分辨率范围为 512 x 512 至 2048 x 2048。这种分辨率可以通过通常在10 - 15 μm之间的像素尺寸来实现。这些像素累积形成大约 30 x 30 毫米的大像素阵列尺寸。体内 OI 应用中最常用的三种检测器由 Teledyne e2v 制造，如表 2 所示。这些探测器具有典型的体内探测器特性，包括空间分辨率、低噪声和高灵敏度。

　　表2： CCD47-10、CCD42-40 和 CCD230-42 传感器最常用于体内成像。在三种不同类型之间可以显示像素间距、满孔容量和峰值QE等特性。

　　通过冷却降噪

　　弱光成像和光谱学应用，例如体内成像，依赖于高灵敏度硅或 InGaAs 科学探测器。为确保高灵敏度，有必要冷却相机以尽量减少热产生的噪声。通过冷却系统，通常在-60之间或C 和 -100或C，并降低噪音，积分时间可以从几分钟到几个小时不等。例如，暗电流是相机在没有光线的情况下产生的热噪声。通过使用真空密封来确保系统冷却，这种背景噪音显着降低。

　　另一个例子是读出噪声，由输出放大器等相机电子设备产生。这种噪点是低光图像的限制因素。通过冷却CCD，传输速率会变慢，同时提高电荷转移效率，整体降低读出噪声。在 InGaAs 相机中， 暗电流可能与读出噪声一样大，通常是低光应用的限制因素。除了暗电流外，InGaAs 相机还受到环境背景辐射的影响。因此，InGaAs 相机必须冷却传感器和光路，以减少这些噪声贡献。

　　尽管多年来科学相机中使用了许多冷却技术(例如热电、低温、焦耳-汤姆逊)，但 热电 (TEC)，也称为帕尔贴冷却，由于其免维护和可靠的运行，已被证明是最具吸引力的。使用 TEC 实现最深的冷却需要多个参数，例如传感器周围的超高真空 (UHV) 环境、无释气材料、无环氧树脂以及永久性全金属气密密封。为了最大限度地提高光通量，最好采用单窗口真空设计。这种设计确保真空窗口是入射光子在到达检测表面之前遇到的唯一光学表面。

　　然而，真空窗口的每个未涂层光学表面可能具有高达 4% 的透射损耗。在弱光应用中成像时，这种损耗会导致信噪比显着降低。此外，系统内部反射的任何光都会导致眩光和边缘，尤其是在与相干照明一起使用时。为了解决这一限制，在光路中的窗口上涂上了 抗反射 (AR) 涂层。

　　这导致透射损耗降低到 <1%，一些涂层达到 <0.5%。为了优化设计，应采用高效的热交换器。热交换器可实现高散热，并具有智能控制，以实现高可靠性和温度稳定性。下图显示了典型的高性能真空组件，以及CCD冷却对暗电流噪声的积极影响。

　　图 5：(A) 典型的高性能真空组件，对于用于体内成像的相机进行深度冷却至关重要。(B)暗噪声与温度的关系，表明随着温度的降低，每秒每像素的电子数减少。

　　总结

　　体内成像是治疗药物开发的重要组成部分，为确定人体临床试验的成功率提供了关键的临床前数据。全动物成像在很大程度上依赖于引入系统中的荧光团来测量潜在药物的有效性，以及功效、安全性、剂量和毒性。

　　体内成像的局限性与空间分辨率、波长穿透深度和生物组织的自发荧光有关。 NIR-I 和 NIR-II 窗口内的荧光团已被开发出来以减少这些限制。NIR-I/-II 荧光团通过减少组织散射、降低组织吸光度和减少组织自发荧光来提高空间分辨率。

　　可见光范围内的荧光团仍然常用于体内成像，因为在此范围内有多种医学批准的低毒性荧光团可用于临床。对于可见光范围荧光团， CCD 传感器通常用于光学成像，NIR-I/-II 荧光团需要 HiRho CCD 或 InGaAs 传感器。这些传感器分别具有 750 - 1050 nm 和 1000 - 1600 nm 的高 QE，因此是 NIR-I/-II 成像的理想选择。为了确保尽可能低的噪声，这些传感器需要深度冷却，尤其是在体内实验中典型的低光成像中。