《食品科学》：集美大学倪辉教授等：基于理性设计同时提高黑曲霉β-甘露聚糖酶的热稳定性和催化活性

刺槐豆胶也被称为槐豆胶、角豆胶，是刺槐树种子经过分离精制出的一种植物胶，含有丰富的异甘露聚糖，主链由甘露聚糖构成，甘露糖残基与半乳糖作为结构单元以 α -1,6-糖苷键连接形成支链 。刺槐豆胶可作为增稠剂、絮凝剂和持水剂，应用于食品、医药、饲料等领域。刺槐豆胶分子质量大约为310～2 000 kDa，其分子质量大、黏度高、生物利用率低。刺槐豆胶的降解产物甘露寡糖具有特殊生物调节功能和保健功能 ，如抗过敏、激活巨噬细胞活性等，在食品和医药等领域具有重要应用价值。甘露聚糖的高效降解是食品加工、农业生产及工业领域（如造纸、洗涤剂）的核心技术环节 。目前甘露聚糖降解的主要方法包括化学法 和生物法 。

刺槐豆胶的酶法降解涉及多种水解该多糖主链和侧链的水解酶，主要包括 β -甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）、 β -甘露糖苷酶（EC 3.2.1.25）、乙酰甘露聚糖酯酶（EC 3.1.1.6）和 α -半乳糖苷酶（EC 3.2.1.22） 。其中 β -甘露聚糖酶最为关键，能够水解主链的 β -1,4-糖苷键（图1）。GH5家族的黑曲霉 β -1,4-甘露聚糖酶具有良好的催化活性，在pH 3.0～9.0范围内具有良好的稳定性，但该酶在60 ℃以上的稳定性不高 。

集美大学海洋食品与生物工程学院的周婕、朱艳冰、倪辉*等对利用FireProt服务器预测黑曲霉

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黑曲霉

野生型黑曲霉 β-甘露聚糖酶的基因序列长度为1 149 bp，理论等电点为4.40，理论分子质量为45.0 kDa。保守结构域分析显示，β-1,4-甘露聚糖酶包含信号肽区域（Met1-Thr38）和GH催化结构域（Ile50-Asp358）（图2A）。利用AlphaFold2在线系统对黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶进行建模，结果如图2B所示。β-1,4-甘露聚糖酶催化结构域的三维结构折叠成经典的(β/α)8-TIM桶状结构，由8 个β-折叠和8 个α-螺旋交替排列构成。8 个β-折叠排列构成了桶状结构，而8 个α-螺旋则围绕在桶状结构的外围，使β-1,4-甘露聚糖酶的活性中心呈现出一个深槽状口袋，为底物的进入与结合提供隧道。本研究中的黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶是具有单个GH5结构域的酶，芽孢杆菌来源的β-甘露聚糖酶BaMan5A也是具有单个GH5结构域的酶。黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶的催化残基由D152、E206和E314构成，具有高度保守性。利用PROCHECK在线工具中提供的Ramachandran图评估β-1,4-甘露聚糖酶模型质量，结果如图2C所示。核心区域和其他允许区域的残基占比分别为93.9%和6.1%；根据VERIFY 3D在线工具分析，β-1,4-甘露聚糖酶模型有97.4%残基的平均3D-1D评分≥0.1，上述结果说明黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶模型建模可信度高，具有良好的立体空间构型。

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黑曲霉

基于折叠自由能的变化（ΔΔG），利用FireProt服务器（https://loschmidt.chemi.muni.cz/fireprot/）的FoldX和Rosetta工具对黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶进行耐热突变体的分析预测，排除保守性强的氨基酸残基，选择ΔΔG＜0的突变体，共筛选出4 个突变体（表2），包括E190S、F258Y、N263D和E325M。

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黑曲霉

黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶去除信号肽后合成其编码基因（1 035 bp），构建野生型及突变体β-1,4-甘露聚糖酶工程菌株。酶诱导表达后，进行β-1,4-甘露聚糖酶及突变体的纯化，SDS-PAGE分析结果显示，黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶及其突变体的蛋白条带清晰且单一（图3A）。大多数甘露聚糖酶的分子质量在35～50 kDa，本研究中黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶及其突变体的分子质量均为45 kDa。

以刺槐豆胶为底物，测定黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶及其突变体的酶活力。如图3B所示，突变体F258Y、N263D和E325M的相对酶活力相较于WT分别提高了14.4%、28.1%和33.8%，突变体E190S的相对酶活力相较于WT降低了31.2%，选择酶活力提高的突变体进行温度稳定性分析。如图3C所示，在不同温度条件下处理60 min后，黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶及其突变体的残余酶活力均随着处理温度的升高而有所下降，在60 ℃条件下处理60 min后，WT、F258Y、N263D和E325M的残余酶活力分别为14.2%、12.1%、6.9%和54.4%，说明突变体F258Y和N263D的残余酶活力相较于WT没有显著变化，而突变体E325M的残余酶活力相较于WT提高了40.2%。如图3D所示，WT和E325M在60 ℃条件下的半衰期（t1/2）分别为59.2 min和72.2 min，后者是前者的1.22 倍。上述结果表明，突变β-1,4-甘露聚糖酶E325M具有更好的热稳定性。

黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶及其突变体E325M的酶学性质比较见表3。E325M的最适反应温度与WT一致，均为60 ℃，表明325位氨基酸突变对β-1,4-甘露聚糖酶的最适温度没有影响，与来源于黑曲霉ATCC 26011的内切β-甘露聚糖酶的最适温度相同。野生型和突变体E325M的最适pH值均为5.0，而大多数甘露聚糖酶最适pH值偏中性，如来源于枯草芽孢杆菌G1的β-甘露聚糖酶最适pH值为6.5，来源于链霉菌Alg-S25的β-甘露聚糖酶最适pH值为7.5。动力学参数测定结果表明，突变体E325M的Km和Vmax分别为14.0 mg/mL和625.0 U/mg，均高于WT的Km和Vmax，表明突变降低了酶与底物之间的亲和力，但提高了酶的最大反应速率，相似的结果出现在黑曲霉BK01的嗜热β-甘露聚糖酶中，突变体Y216W相较于野生型的Km和Vmax均增大。同样来源黑曲霉或GH5家族β-甘露聚糖酶的酶学性质比较见表4，通过分子改造后的突变酶E325M可以在60 ℃条件下稳定较长时间，该突变酶的热稳定性高于部分天然β-甘露聚糖酶，提高了E325M在工业上的应用潜力和价值。

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黑曲霉

荧光光谱主要通过测定蛋白质中色氨酸和酪氨酸残基的极性环境表征蛋白质三级结构的变化。如图4A所示，2 个酶均在331 nm波长处具有最大荧光强度，说明325位的突变没有改变酶的三级结构。蛋白质的疏水性对高温下蛋白质的稳定和蛋白质折叠起着重要作用。与埋藏的疏水位点相比，ANS等荧光探针在与蛋白质暴露表面结合时，可以通过不同的稳态荧光检测蛋白质暴露的疏水斑块。如图4B所示，突变体E325M相比WT在320～350 nm波长范围的荧光强度略有上升，表明蛋白质的表面疏水性发生了微小的变化。在高温条件下蛋白质的表面疏水性决定其稳定性和折叠作用，能够改变蛋白质的微环境以增强蛋白的稳定性。

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黑曲霉

蛋白质的表面电荷变化对酶的热稳定性具有重要影响 。突变体E325M位于蛋白质表面的 α -螺旋区域，远离酶的催化活性中心。如图5所示，WT的Glu325位于蛋白质表面的局部负电位区，当带负电荷的Glu325突变为不带电的Met325时，可以观察到突变位点周围正电荷分布的增加。蛋白质表面电荷的优化有利于提高它的热稳定性 。本研究中，突变体E325M蛋白质表面的静电电位产生了有利的变化，优化了酶的表面电荷分布，有利于突变体保持稳定的构象，从而提高了 β -1,4-甘露聚糖酶的热稳定性。

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黑曲霉

分子对接可用于预测配体在与蛋白质相互作用时的取向，提供它们的相互作用信息。本研究中，野生型β-1,4-甘露聚糖酶、E325M与甘露四糖底物的对接结合能量分别为-6.80 kcal/mol和-7.10 kcal/mol，突变体与底物的结合能更低，说明突变体对甘露四糖底物的结合更加稳定。野生型β-1,4-甘露聚糖酶有5 个残基（D152、E242、Y254、W285、E314）通过5 个氢键与甘露四糖相互作用，11 个残基（Y149、W150、N205、E206、P210、F244、E260、Y281、S284、W344、D358）通过范德华力进一步稳定了复合物（图6A）。当325位的Glu突变为Met后，E325M-配体复合物相较于WT-配体复合物具有更少的范德华力，有8 个残基（W92、D152、E206、R208、P210、F244、E260、Y281）通过范德华力与甘露四糖相互作用，有8 个残基（Y149、W150、E242、S284、W285、W344、D358、N360）通过8 个氢键与甘露四糖相互作用（图6B）。另外，突变体和底物之间的疏水相互作用相较于WT-底物复合物减少了3 个疏水残基（图6C、D）。氢键被归类为静电相互作用，对蛋白质折叠有重要贡献。本研究中突变体与底物的氢键作用增强，这是可能是导致突变β-1,4-甘露聚糖酶E325M催化活性提高的原因。

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黑曲霉

分子动力学模拟可以分析突变前后蛋白质整体构象的变化。RMSD是反映蛋白质稳定性的重要参数，较低的RMSD表明酶的构象稳定性较好。在333 K时E325M的平均RMSD（0.35 nm）低于WT（0.38 nm）（图7A），表明325位氨基酸残基的突变增加了E325M的刚性。Rg表示蛋白质系统的膨胀程度。E325M的平均Rg（1.96 nm）与WT（1.95 nm）无显著差异（图7B），说明突变对酶的总体Rg无影响，可能是由于突变的位置远离酶的活性中心，在其他研究中也观察到了类似的结果。RMSF反映了模拟期间每个氨基酸残基的波动，RMSF越高残基的灵活性越高。突变体E325M整体构象的RMSF比野生型低（图7C），表明325位氨基酸残基突变后酶的柔性降低。如图7D、E所示，突变后E325M柔韧性降低的区域主要集中在α-螺旋区（I65-L86、S116-D139、F282-L311和D327-S382），这些区域刚性的增强可能是突变体E325M热稳定性提高的原因。另外，突变后E325M柔韧性增加的区域主要集中在β-折叠区（S39-G45、Q46-I50、E53-A58和V91-F94）和loop区域（D152-V160、S166-Q178、N205-C212、W220-I228、S253-P255、F258-E260和V317-S327）。D152-E206-E314是黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶的催化三联体，突变体中催化残基D152和E206的柔韧性增强，有利于增强其催化活性。

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黑曲霉

利用LC-MS分析黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶及其突变体E325M降解刺槐豆胶的产物组成。m/z 383、545、707、869对应的降解产物分别为甘露二糖（M2）、甘露三糖（M3）、甘露四糖（M4）和甘露五糖（M5）。野生型β-1,4-甘露聚糖酶能够将刺槐豆胶降解成聚合度分别为2、3、4和5的甘露寡糖（图8A）；突变体E325M的酶解产物也包括甘露二糖、三糖、四糖和五糖（图8B）。上述结果表明，突变没有改变β-1,4-甘露聚糖酶的切割方式和最终降解产物。不同来源β-甘露聚糖酶降解刺槐豆胶所得产物大不相同。如Talaromyces cellulolyticus来源β-甘露聚糖酶（Man5A）降解刺槐豆胶生成二糖、三糖和四糖的甘露寡糖；Trichoderma reesei来源甘露聚糖酶降解刺槐豆胶生成甘露糖、二糖和少量三糖的甘露寡糖。

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结 论

本研究基于FireProt服务器的理性设计，成功筛选到黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶热稳定性和催化活性同时提高的突变体E325M。通过表面电荷、分子对接和分子动力学模拟等分析突变前后β-1,4-甘露聚糖酶的微观结构变化，发现E325M表面电荷的优化、酶与底物氢键相互作用的增加、一些α-螺旋区域刚性增加和重要催化残基的柔韧性增强可能是该突变体热稳定性和催化活性同时提高的原因。通过定向突变增强β-1,4-甘露聚糖酶热稳定性和催化活性，可为黑曲霉β-1,4-甘露聚糖酶的分子改造和工业应用提供理论参考。

本文《基于理性设计同时提高黑曲霉

实习编辑：陈丽先；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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