浙江
小师妹
这稿件直接决定我是否按时毕业，可审稿人反馈说里面的 WB 数据可信度不足，这条带那么清晰，为什么被质疑真实性？
你的内参和目标蛋白的信号是不是没在同一张膜上？
大师兄
小师妹
分子量有差异，肯定要裁膜并分步孵育抗体，同一张膜上呈现信号，这不是为难我吗？
我们可以用杂志推荐的总蛋白归一化，全膜同时检测目的蛋白和总蛋白，无需染色就可以获取目的蛋白表达差异，还不用担心内参跑不齐。如果不做，可能会出现系统性偏差，导致生物学结论误判，审稿人自然会质疑结果的可靠性。
大师兄
随着期刊杂志对 WB 数据的要求越来越严格，提供带 marker 的全膜图像已逐渐变成数据提交的基本要求。大部分期刊如
Nature、Cell、JBC、J CELL BIOCHEM等已经加强对 WB 实验数据的要求，涉及原始图片提交、泳道分割和 Marker 等等。但是由于抗体特异性和表达量差异，大多数情况下需要裁膜、洗膜分别获取内参和目的蛋白的信号， 总蛋白归一化就通过量化全泳道的蛋白总量来校准数据，能有效消除上样误差、转膜效率差异等干扰。本文将聚焦归一化策略，助你获取更可靠的 WB 数据！
为什么要做归一化计算？
WB 实验涵盖样本制备、上样电泳、转印封闭到孵育成像等环节，通常需 1~2 天才能获得可分析数据。实验人员的操作习惯与环境条件均可能对最终结果产生显著影响（如图1）。
图1. 不同实验人员使用同一样品进行 WB 实验定量分析
图 1 所示为三位实验人员使用同一样品获得的 WB 结果，Cy3（绿色）为目标蛋白，Cy5（红色）为总蛋白。在同一张膜上，直接使用 Cy3 目标蛋白信号计算，不同泳道间 CV 值 >6%。利用 Cy5 进行归一化后 CV 值由最大 9.8% 降低至 5%。结果表明实验中需依赖参比数据才能提高定量准确性。
总蛋白归一化的必要性
WB 实验中，传统内参常选用看家蛋白（如 GAPDH、β-Actin、Tubulin），其理想特性为不受实验及病理条件影响的内源性稳定表达。但大量文献证实，在组织差异、细胞应激、药物处理、疾病模型等多种实验条件下，这类蛋白的表达水平会显著波动。例如，缺氧、代谢紊乱等病理条件可诱导 β-actin 表达下调，细胞周期同步化处理会导致 GAPDH 表达不稳。
鉴于传统内参的局限性，基于泳道总蛋白信号进行参比计算的「总蛋白归一化」方法，逐渐获得科研领域认可，例如《
Journal of Biological Chemistry》已明确推荐该方法用于 WB 数据归一化（图 2）。
图 2. JBC 杂志对归一化计算的方法要求
以 CHO 细胞裂解液样品为例，梯度稀释后进行 2 次重复上样，计算 ERK1/2 蛋白分别使用总蛋白、看家蛋白 Tubulin、Actin、GAPDH 进行归一化时的变异系数 CV 值（图 3.4）。
图 3. 总蛋白归一化结果
图 4. 看家蛋白归一化结果
最终统计结果显示，总蛋白归一化后的 CV 值仅 7%，而看家蛋白普遍 >10%。使用总蛋白归一化的方式可以有效降低上样差异和内参蛋白表达差异，有利于获得更真实的表达量变化。
如何做蛋白归一化计算？
1、样品标记
Cytiva Amersham Quick Stain（货号：RPN 4000）总蛋白检测试剂盒以 40 ul WB 实验体积为例：
1. 19 ul 样品裂解液+1 ul Cy5 染料工作液混匀；
2. 室温孵育 3-30 分钟；
3. 加入 20 ul 2xLoading buffer 混匀；
4. 95 ℃ 加热 3 分钟后短暂离心准备电泳上样；
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2、印迹膜选择指南
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3、封闭孵育
Amersham ECL 封闭剂
每包含 40 g 封闭试剂，可完成 >20 次的小量封闭实验，与 ECL 检测试剂配合使用效果更佳。
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Amersham ECL HRP 偶联二抗
具有高种属特异性，与 ECL 检测试剂配合使用，可以最优稀释比例获得更低背景。
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Amersham ECL Plex CyDye 偶联二抗
它是 ECL Plex、Cy3 及 Cy5 偶联的抗体，利用 CyDye 荧光标记，可进行多波长扫描，无需 Stripping 和 Reprobing，减少误差，高特异性检测蛋白。
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Amersham CyDye NIR 二抗
Amersham CyDye 700 和 800 二抗标记有 NIR荧光团，可发射 700 nm 或 800 nm 波长的光。Amersham cyDye 700 和 800 二抗与一对合适的免或小鼠一抗配合使用，可以实现多重实验。
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4、成像
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5、分析
IQTL-Blot Analysis
1. 打开需要分析的图片；
2. 泳道识别、背景扣除、条带识别（目的蛋白）；
3.在均一化中方法选择 Total Protein，参比通道选择荧光，均一化因子选择 Total Lane Volume；
4. 以柱状图或表格形式展示，结果以图片、PDF 报告或文档形式导出。
内容策划：王丹琦
内容审核：周育红
题图及文中图片来源：Cytiva 思拓凡
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