217例样本颠覆认知！顶刊揭露90%医生不知道的CAR-T耐药真相

CAR-T细胞疗法被誉为癌症治疗的“活的药物”，为复发难治性淋巴瘤患者带来革命性突破。然而，为何部分患者疗效显著，而另一些却迅速耐药？答案或许藏在肿瘤微环境的“幕后黑手”中。 近日，由德州大学MD安德森癌症中心Michael R. Green教授领衔的国际团队在《Cancer Cell》发表重磅研究。他们通过对217例大型B细胞淋巴瘤（LBCL）样本进行单核多组学测序（snMultiome），首次揭示了三种肿瘤微环境原型（LymphoMAPs），并发现其中一种原型与CAR-T耐药密切相关。这一发现不仅刷新了科学界认知，更为攻克耐药难题提供了全新方向。

一、背景：肿瘤微环境的迷雾亟待拨开

大型B细胞淋巴瘤（LBCL）是一类高度异质性的恶性肿瘤，其肿瘤微环境（LME）包含复杂的免疫细胞、基质细胞和血管网络。既往研究表明，LME在淋巴瘤进展和治疗反应中扮演关键角色——它既能支持肿瘤生长，又能抑制免疫细胞功能。然而，传统研究方法（如批量转录组测序）只能提供“平均值”信息，无法解析微环境中不同细胞类型的相互作用。

更严峻的是，CAR-T疗法对约60%的复发难治患者无效，但耐药机制尚不明确。虽然部分研究将耐药归因于T细胞耗竭或巨噬细胞浸润，但这些结论缺乏系统性证据。为此，Green团队提出核心问题：LME是否存在稳定且可分类的“原型”？这些原型是否与CAR-T疗效直接相关？

图文摘要

二、研究思路：单细胞技术“透视”微环境全景

研究团队设计了一套严谨的技术路线：

1.样本收集：纳入217例LBCL肿瘤样本（含110例初治、107例复发难治）及15例对照样本。

2.单核多组学测序：采用单核ATAC+RNA联合测序（snMultiome），全面捕获微环境中各类细胞的转录组和表观遗传特征。

3.细胞分型与聚类：通过非负矩阵分解（NMF）等算法，将非恶性细胞分为71个功能亚群（如T细胞、巨噬细胞、癌症相关成纤维细胞等）。

4.原型识别：基于细胞亚群的共现模式，提炼出三类微环境原型（LymphoMAPs）。

5.功能验证：结合体外实验（如TGF-β刺激成纤维细胞、IFNγ处理巨噬细胞）验证关键机制。

6.临床关联分析：在独立队列（如ZUMA-1/7临床试验）中验证原型与CAR-T疗效的关系。

三、结果：三类微环境原型决定CAR-T命运

1、全景细胞图谱：揭示LBCL微环境的精细结构

研究团队通过snMultiome分析并构建了迄今最全面的LBCL微环境（LME）细胞图谱（图1A）。关键发现包括：

·71个细胞亚群被精准识别，涵盖B细胞、T/NK细胞、髓系细胞和非造血细胞（NHCs）（图1E）；

·巨噬细胞（10个亚群）、非内皮基质细胞（NESC，12个亚群）及血管内皮细胞（BEC/HEV，8个亚群）展现出惊人的异质性；

·LME细胞占比高达59.8万个，跨患者样本的细胞聚类高度一致，证明技术有效消除批次效应（图1C-D）。

图1 snMultiome分析的研究设计和细胞类型概述

该图谱不仅揭示了LBCL的细胞复杂性，更凸显基质细胞与髓系细胞在免疫调控中的核心作用。未来靶向特定CAF亚群或可打破物理屏障，增强T细胞浸润——例如抑制TGF-β信号可能逆转CAF介导的免疫排斥。

2、LymphoMAPs的发现与定义

通过非负矩阵分解（NMF）聚类细胞组成模式，研究者提炼出三大微环境原型（图2C-F）：

·FMAC原型（37%）：T/NK细胞稀缺，富集癌症相关成纤维细胞（CAF）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）。TGF-β信号主导CAF活化，形成物理屏障阻碍T细胞浸润。

·LN原型（33%）：富集幼稚/记忆T细胞及淋巴结结构细胞（如MRC、FDC）。基质细胞分泌IL-7、CCL21等因子，维持T细胞存活与功能。

·TEX原型（30%）：耗竭CD8+ T细胞（高表达PD-1、TIM-3）与超活化巨噬细胞（高表达SLAMF7、PD-L1）共存。PD-1/PD-L1介导T细胞耗竭，IFNγ驱动巨噬细胞活化，形成耐药恶性循环。

图2 通过LME细胞组成的NMF聚类鉴定LymphoMAPs

TEX原型中IFNγ的双刃剑效应尤为关键——它既是巨噬细胞活化的引擎，又是T细胞耗竭的推手。靶向这一通路（如抗IFNγ抗体联合CAR-T）或可打破恶性循环。而LN原型中的IL-7信号，有望成为增强CAR-T持久性的新靶点。

3、FMAC原型：TGF-β信号驱动的免疫排斥屏障

FMAC原型以癌症相关成纤维细胞（CAF）和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的协同主导为标志（图3A-C）。CAF通过高表达胶原蛋白（如COL1A1）和整合素（如ITGB1），形成物理屏障阻碍T细胞浸润（图3B, S3E）。CellPhoneDB互作分析揭示，TGF-β和PDGF是CAF活化的核心信号通路：恶性B细胞、巨噬细胞及内皮细胞分泌TGFB1/PDGFA/B，而CAF高表达其受体TGFBR1/PDGFRB（图3D-E, S3C）。功能验证显示，TGF-β处理正常人源成纤维细胞48小时后，诱导79个CAF特征基因显著上调（图3G），包括α-SMA（ACTA2）和ECM重塑基因（MMP11）。基因集富集分析（GSEA）进一步证实，TGF-β可激活CAF的TGF-β响应基因模块（图3H）。临床关联分析表明，FMAC原型与高侵袭性分子亚型（如DZsig+）显著正相关，且在≥3线治疗患者中占比高达45%，提示其与治疗耐药和疾病进展密切相关。

图3 FMAC原型的特征和细胞间通讯与CAF的通讯

4、LN原型：淋巴结结构模拟与T细胞生存支持

LN原型保留了正常淋巴结的微环境架构（图4A-C），其特征是滤泡树突细胞（FDC）和边缘区网状细胞（MRC）富集。MRC高表达黏附分子VCAM1，促进T细胞归巢至肿瘤区域（图4C）。关键细胞因子分析显示，MRC大量分泌IL-7（图4I），直接支持CD4+幼稚/记忆T细胞的存活与扩增（图4G）。细胞互作网络分析证实，LN原型中富集CCL19-CCR7、IL7-IL7R等通路（图4F），形成T细胞功能性"庇护所"。此外，组织驻留巨噬细胞（TRM）高表达IL-15和IL-18（图4E），进一步强化T细胞活化信号。临床意义方面，LN原型多见于初治患者（占33%），且ZUMA-7临床试验中接受CAR-T治疗的LN型患者12个月无事件生存率（EFS）达71%，凸显其微环境对细胞疗法的协同增强作用。

图4 LN原型的特征和细胞间通讯与幼稚/记忆CD4 T细胞的通讯

5、TEX原型：耗竭T细胞与超活化巨噬细胞的互作闭环

TEX原型呈现免疫耗竭的正反馈循环（图5A-F）。耗竭CD8+ T细胞高表达抑制性受体（PDCD1、HAVCR2、CTLA4）及转录因子TOX（图5B），并富集NFAT信号通路活性（图S6C）。超活化巨噬细胞（C4:Mac_Sup.Act.）同步高表达PD-L1（CD274）和SLAMF7（图5C-D），通过PD-1/PD-L1轴直接抑制T细胞功能（图5G）。CellPhoneDB预测与实验验证揭示核心互作机制：

T细胞→巨噬细胞通路：耗竭CD8+ T细胞分泌IFNγ，通过IFNGR激活巨噬细胞（图6B-D）；

巨噬细胞→T细胞通路：超活化巨噬细胞分泌CXCL9和LGALS9，分别结合CXCR3和TIM-3，招募并抑制T细胞（图5F）。 功能实验中，用耗竭T细胞上清（TEx sup.）处理体外培养的巨噬细胞，可显著诱导SLAMF7和PD-L1表达上调（图6G），且GSEA证实IFNγ响应基因模块富集（图6I）。临床转化价值明确：TEX原型患者接受CAR-T治疗后12个月EFS仅39%，与标准化疗疗效无差异（图8F），提示需联合PD-1抑制剂或IFNγ阻断剂以打破免疫抑制循环。

图5 与CD8 T细胞耗竭相关的TEX原型和信号的表征

图6 IFNγ对巨噬细胞的超级激活

6、临床关联：治疗响应与生存预后的分型标志

三大原型显著影响治疗响应（图7-8）：

·治疗线数差异：FMAC在≥3线治疗患者中比例达45%，而LN多见于初治患者（1L占比37%）（图7B）。

·分子亚型关联：TEX与ABC亚型、LN与GCB亚型、FMAC与DZsig+亚型显著相关（图7H）。

·CAR-T疗效分层：

oLN原型在ZUMA-7试验中12个月EFS率达71%（图8D）；

oTEX原型EFS仅39%，CAR-T未显显著优势（图8F）；

oFMAC原型EFS为41%，虽优于化疗但疗效有限（图8E）。 基于此，研究提出精准治疗框架：LN型患者优先选择CAR-T；TEX型需联合免疫检查点阻断；FMAC型可能受益于TGF-β抑制剂（如Galunisertib）以削弱基质屏障。

图7 淋巴MAPs与临床和分子特征的关联

7、空间异质性与动态演变的未解挑战

尽管LymphoMAPs提供新范式，仍存在关键局限（图7, S7）：

1.空间盲区：单细胞技术无法解析PD-L1+巨噬细胞与耗竭T细胞的物理共定位（如空间邻域关系）；

2.原型可塑性：化疗后FMAC比例升高（图7B），但原型是否随治疗动态演变需前瞻性验证；

3.模型缺失：缺乏重现TEX原型的动物模型，阻碍机制研究与药物筛选。 未来需结合空间转录组（如Visium）和连续活检追踪，推动原型动态监测与干预策略优化。

图8 LME原型与CD19 CAR T细胞治疗结果的相关性

四、讨论与结论：改写临床实践的分型革命

本研究通过单核多组学技术率先解析了大型B细胞淋巴瘤（LBCL）的LymphoMAPs，颠覆了传统耐药机制认知。研究发现，微环境中细胞群落的协同作用是CAR-T疗效差异的核心驱动因素。在TEX原型中，耗竭CD8+ T细胞（高表达PD-1/TIM-3）与超活化巨噬细胞（高表达SLAMF7/PD-L1）形成自我强化的耐药闭环：PD-1/PD-L1信号抑制T细胞功能，而耗竭T细胞分泌的IFNγ持续激活巨噬细胞，最终构成免疫抑制恶性循环。这一发现解释了为何单纯阻断PD-1疗效有限——同步靶向IFNγ通路（如抗IFNγ抗体联合CAR-T）方能打破循环。

基于原型特征，研究提出“分型而治”的精准策略：对于LN型患者，微环境富含支持性因子（IL-7/CCL21），CAR-T疗效最佳（ZUMA-7试验12个月无事件生存率达71%），应作为首选方案；TEX型患者需联合免疫检查点抑制剂（抗PD-1）或IFNγ阻断剂（如恩帕利单抗），阻断耗竭-抑制循环；而FMAC型患者则可通过TGF-β抑制剂（如Galunisertib）削弱CAF介导的物理屏障，增强T细胞浸润。

值得注意的是，微环境原型与遗传亚型（ABC/GCB）不完全重叠，提示其作为独立预后标志物的潜力。团队开发的LymphoMapR工具支持基于常规RNA数据快速分型，为临床推广奠定技术基础。然而，该框架仍需突破三大局限：其一，单细胞技术无法解析局部空间互作（如PD-L1+巨噬细胞与耗竭T细胞共定位），需结合空间转录组技术；其二，原型可能随治疗动态演变（如化疗后FMAC比例升至45%），需前瞻性追踪验证；其三，缺乏模拟TEX耐药闭环的动物模型，亟待构建人源化CAF-CAR-T共移植系统。

五、文末总结

肿瘤微环境的“黑匣子”终于被打开！这项针对LBCL样本的研究，以单细胞精度绘制了微环境的三大原型图谱，尤其揭露了TEX型作为CAR-T耐药“幕后推手”的机制本质：耗竭T细胞与巨噬细胞通过PD-1/IFNγ轴形成的致命闭环。这一发现不仅解答了为何40%-60%患者对CAR-T无响应，更指明了破解路径——双靶向PD-1与IFNγ信号可能成为下一代免疫治疗的突破口。

肿瘤治疗的成功离不开对微生态的精准调控。当我们将视野从癌细胞扩至整个肿瘤，破解细胞间对话的密码，才能真正征服耐药顽疾。未来，基于原型的个体化策略或将让更多患者受益于免疫治疗的曙光。

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