FC | 南京农业大学黄明教授团队：羟自由基诱导肌原纤维蛋白氧化对晚期糖基化终产物形成的影响

近日，南京农业大学黄明教授团队在中科院一区

Food Chemistry

1 引 言

晚期糖基化终产物（advancedglycationendproducts，AGEs）是美拉德反应后期生成的一类有害化合物，在食品基质中，Nε-羧甲基赖氨酸（Nε-carboxymethyllysine，CML）和Nε-羧乙基赖氨酸（Nε-carboxyethyllysine，CEL）是评估AGEs含量最常用的指标。现代医学研究已证实，这类化合物在体内的过量蓄积与多种代谢疾病密切相关，如糖尿病、动脉粥样硬化以及与氧化应激相关的神经退行性疾病。肉类因其高蛋白和高脂肪含量，在加工过程中极易形成AGEs。目前，科学界普遍认为美拉德反应和脂质氧化是加工肉制品中AGEs生成的主要机制。在这些过程中，食品成分通过氧化和降解会产生乙二醛（glyoxal，GO）、甲基乙二醛（methylglyoxal，MGO）等高活性羰基化合物，为AGEs的生成提供必要前体

然而，近年来的研究凸显了蛋白质氧化在AGEs形成中的关键作用。有研究表明，Cu²⁺和OH－诱导的蛋白质氧化会产生羰基化合物，进而促进AGEs的产生；还有研究发现蛋白质氧化程度通过蛋白质结构修饰和CML形成位点的暴露，对 CML的形成产生不同影响。研究团队也发现，油炸、煎制等剧烈热加工方式会显著增强鸭肉中蛋白质的氧化并促进其聚集，这是 CML生成的主要原因。尽管这些研究已经阐明了蛋白质氧化对蛋白质结构的影响会导致AGEs水平变化，但其中潜在的分子机制，尤其是具体的化学修饰过程，仍需进一步系统研究。

鸭肉在全球范围内被广泛消费，在亚洲地区的消费量尤其高。在鸭肉肌肉中，肌原纤维蛋白（myofibrillar proteins，MPs）在加工和贮藏过程中，容易受到羟自由基（・OH）等活性氧诱导而发生氧化改变。热加工不仅会增加猪肉中的阿马多里产物和AGEs，还会通过交联修饰促进蛋白质聚集，但这些研究多聚焦于肉类品质劣变，并未探究氧化诱导的蛋白质聚集与AGEs形成之间的关系。

基于上述理论基础，研究人员提出假设：蛋白质氧化可能通过蛋白质聚集和修饰来调节AGEs的形成。为验证这一假设，研究建立了・OH诱导的MPs氧化模型，结合基于蛋白质组学的修饰分析和多光谱分析方法，系统研究了不同氧化水平（轻度、中度和重度）如何调节蛋白质聚集，进而影响AGEs形成位点的分布，并旨在提出一个机制框架来解释这种关系。

2 结果与讨论

2.1 羰基和巯基含量变化时

蛋白质羰基化是蛋白质氧化修饰的主要形式之一。由芬顿反应产生的・OH会介导特定氨基酸（赖氨酸、苏氨酸、精氨酸和脯氨酸）的侧链直接氧化，这是蛋白质羰基化的主要途径。如图1A所示，随着・OH诱导氧化程度的不断加剧，MPs的羰基含量显著增加（P＜0.05），这一现象表明氨基酸残基的羰基化程度在增强，与以往部分研究结果一致。值得注意的是，这些由氧化产生的羰基基团会与相邻的游离氨基发生羰基-胺缩合反应，形成共价键，进而促进蛋白质交联，同时，这些羰基基团也可能成为AGEs形成的重要前体物质。

巯基含量的降低是蛋白质发生氧化的一个重要标志。随着氧化强度的增加，总巯基含量呈现出逐渐下降的趋势，而活性巯基含量则先下降后回升。只有在重度氧化条件（L组）下，二硫键含量才出现显著降低（P＜0.05）。出现这种现象的原因是，本研究建立的轻度至中度氧化（S组、M组）体系中，・OH浓度低于以往部分研究中的浓度，导致蛋白质之间的相互作用相对温和，对二硫键未产生显著影响。在重度氧化条件下，可能会出现2 种情况：一是部分巯基基团被埋藏在蛋白质结构内部，避免了被氧化，从而使活性巯基含量有所增加；二是更强烈的氧化作用会将巯基基团转化为亚磺酸或磺酸基团，进而导致二硫键形成减少。因此，当・OH诱导MPs发生氧化时，非二硫键相互作用在蛋白质聚集中也可能发挥着重要作用。

2.2 傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）分析

图1C展示了・OH诱导氧化后，冻干鸭肉MPs的FTIR。4 个处理组在约3300.57 cm－1处均出现了特征羟基峰，这一峰值对应着羟基的暴露情况。随着氧化水平的不断提高，4 个处理组的峰值强度分别为43.68%、49.30%、59.63%和34.34%。这些结果表明，在轻度至中度氧化（S组、M组）条件下，MPs中羟基的可及性得到了增强。然而，在重度氧化条件（L组）下，羟基暴露减少，这会破坏分子内的氢键网络，进而改变蛋白质的二级结构和聚集行为。

FTIR光谱能够有效表征蛋白质的二级结构，其中酰胺I带（1700～1600 cm－1）和酰胺II带（1600～1500 cm－1）是关键的分析区域。酰胺I带可以区分多种结构基序，如α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲，酰胺I带的波数存在波动，同时带宽变宽。从对照组（C组）到中度氧化组（M组），峰强度逐渐增加，而在重度氧化组（L组）峰强度则有所下降。这表明・OH诱导的氧化作用促使MPs发生结构转变，导致β-折叠和无规卷曲含量增加。

2.3 蛋白质二级结构变化

圆二色谱光谱在208 nm和222 nm附近出现了2 个特征负峰，这表明MPs中存在α-螺旋结构。当蛋白质发生氧化后，这些峰的强度显著降低，意味着α-螺旋相对含量减少。与对照组（C组）相比，轻度氧化（S组）使β-折叠相对含量增加到27.13%，中度氧化（M组）则使无规卷曲相对含量升高到44.40%。值得注意的是，重度氧化（L组）进一步将β-折叠相对含量增加到30.63%，这一结果表明氧化作用导致MPs中的α-螺旋向β-折叠和/或无规卷曲转变，这与FTIR光谱的结果一致。这种转变是由于・OH破坏了维持α-螺旋结构稳定性的关键作用力——羰基氧和酰胺氢之间的氢键，从而使蛋白质构象从有序状态转变为无序状态。因此，・OH诱导的分子间作用力变化改变了MPs的二级结构，降低了其结构稳定性，并促进了蛋白质的聚集。

2.4 蛋白质三级结构

表面疏水性可反映蛋白质构象变化，荧光探针ANS特异性结合疏水性残基，其荧光强度与蛋白质表面疏水性正相关。图2A显示，随氧化水平提高，ANS最大吸收峰强度增加，表明蛋白质表面疏水性增强，证明・OH诱导蛋白质构象改变。

氧化MPs的内源荧光光谱（图2B）可反映蛋白质微环境变化，为三级结构变化提供信息。轻度（S）和中度（M）氧化时，荧光强度降低，可能是蛋白质部分解折叠使色氨酸、酪氨酸等内源荧光团暴露于溶剂导致荧光猝灭，或荧光团直接氧化发生化学修饰所致；而重度氧化（L）时，荧光强度较对照组（C）增加，可能是MPs聚集与交联屏蔽了荧光团。

拉曼光谱法通过测定I₇₆₀ cm－1/I₁₀₀₃ cm－1和I₈₅₀ cm－1/I₈₃₀ cm－1的比值，可分别反映色氨酸（tryptophan，Trp）和酪氨酸（tyrosine，Tyr）的暴露水平。图2C显示，Trp和Tyr暴露水平在中度氧化组（M）最高、重度氧化组（L）最低，轻度氧化组（S）与对照组（C）相近，说明M组中Trp和Tyr暴露最充分，L组中则部分被掩盖或修饰，与内源荧光光谱结论一致。

2.5 Zate电位与粒径

Zeta电位表征MPs表面电荷状态，所有・OH氧化处理组MPs均带负Zeta电位，轻度和中度氧化组（S、M）的Zeta电位绝对值逐渐增加，而重度氧化组（L）Zeta电位绝对值较低，表明蛋白质分散体系稳定性下降，易促进蛋白质-蛋白质相互作用并最终导致聚集。轻度和中度氧化组（S、M）平均粒径大于对照组（C），且双峰分布向小粒径方向移动，说明MPs结构部分解折叠；重度氧化组（L）平均粒径较对照组（C）增加57.25%，表明重度氧化使MPs形成大量聚集体，可能影响赖氨酸、精氨酸等AGEs形成位点的可及性，进而影响AGEs形成。

2.6 MPs修饰位点分析

蛋白质组学分析显示，・OH氧化的MPs中多数修饰类型的位点数量增加，表明蛋白质氧化增强氨基酸残基暴露，促进后续化学修饰；但羧甲基化（carboxymethylation，CML）和α-氨基己二酸半醛（α-aminoadipic semialdehyde，AAS）在重度氧化组（L）水平降低，可能是重度氧化诱导的交联蛋白质聚集体屏蔽了前体赖氨酸残基，降低其修饰可及性。

2.6.1・OH介导的修饰位点定量变化

图3B、C的Venn显示，4 组处理共含125 个氧化（Ox）共同位点，且特有位点数量逐渐增加（59、81、107、162 个），表明氧化水平提高使MPs更多氨基酸侧链发生氧化修饰。含硫残基（半胱氨酸、蛋氨酸）因氧化敏感性高易与氧化剂反应，其氧化主产物二硫键促进蛋白质聚集，次级产物（亚磺酸、磺酸、亚砜、砜）则破坏蛋白质结构。本研究中，氧化处理改变MPs化学微环境，使赖氨酸、精氨酸残基倾向不同修饰途径，且不同氧化强度下羰基化与AGEs相关修饰位点结合偏好不同。以AAS和CML为例，氧化组（S、M、L）与对照组（C）的CML共享位点分别为14、14、8 个，特有位点分别为28、48、30 个；AAS共享位点分别为2、5、2 个，特有位点分别为14、17、18 个。共享位点数量波动及大量特有位点形成，表明MPs解折叠与再聚集的聚集行为变化，影响AGEs和羰基化产物在氨基酸序列上的分布。

2.6.2修饰位点的蛋白质来源

图4显示，所有修饰类型中肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）修饰比例始终最高，说明羰基化与AGEs相关修饰主要发生在MHC而非肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）。

此外，氧化处理诱导MPs出现新修饰位点，对照组中未修饰或低修饰的蛋白质（如肌动蛋白、原肌球蛋白）氧化后羰基化与AGEs修饰显著增加。与对照组相比，・OH氧化使AGEs修饰相关蛋白质中肌动蛋白比例增加，羰基化修饰蛋白质中肌动蛋白、原肌球蛋白比例也升高，这可能是蛋白质构象变化与交联修饰共同导致结构松散，使修饰位点暴露于活性氧环境。且重度氧化组中MHC修饰比例最高，其他MPs比例低于轻度/中度氧化组（图4D、H），可能是重度氧化增加MHC额外修饰位点暴露或掩盖其他蛋白质反应性位点，但具体机制需进一步研究。

2.6.3修饰的分布与相互作用

修饰会导致肽段质量变化，鉴于多数修饰分布在MHC上，研究从UniProt数据库选取2 个代表性MHC序列总结修饰情况并可视化空间分布。结果显示，多数修饰集中在C端区域，MHC中部和尾部结构域因结构松散更易发生修饰，紧密折叠的N端头部结构域修饰位点较少；但・OH氧化使N端区域修饰数量增加，表明氧化应激降低MHC头部结构域紧凑性，促进靠近N端残基化学修饰。

其次，羰基化修饰与AGEs形成位点的相互作用可能是自由基诱导氧化影响AGEs形成的关键。蛋白质氧化产生的羰基化合物含高反应性ε-醛基，如AAS可进一步氧化为α-氨基己二酸（α-aminoadipic acids，AAA），或与ε-氨基形成席夫碱。本研究中仅检测到少量AAA，且羰基化与AGEs修饰常出现在相同或相邻位点（图6），因此推测・OH诱导下多数羰基化修饰通过美拉德反应形成席夫碱，席夫碱氧化裂解产生的GO、MGO等二羰基化合物，可作为CML和CEL的前体。

最后，某些特定位点更易发生羰基化或AGEs形成（图5），如A0A8B9TVK1中的K₆₀₁、K₉₀₈、K₁₅₄₁、K₁₆₇₂、K₁₇₃₃，A0A8B9TTL6中的R₁₁₅₂、K₁₆₇₁、R₁₈₂₃，这些位点可能与AGEs前体反应性更高。轻度/中度氧化时（图6B～C、6F～G），赖氨酸、精氨酸残基充分暴露，使羰基化与AGEs相关修饰同时增加；但重度氧化时（图6D、H），残基可及性降低改变修饰模式，且因羰基化是AGEs形成的多步反应前体，有限的残基暴露会优先促进羰基化而非AGEs生成。

2.7 CML和CEL水平

蛋白质组学分析显示 CML和CEL是MPs中最丰富的AGEs修饰类型，因此对其进行定量分析。轻度至中度氧化（S＝0.1 mmol/L、M＝1 mmol/L）时，随・OH浓度升高，CML（627.62～726.20 ng/g）和CEL（713.75～1443.98 ng/g）含量增加。分子水平修饰分析表明，蛋白质解折叠增加氨基酸残基暴露，促进氧化修饰引发的羰基化，且赖氨酸ε-氨基可及性提高增强其与羰基化合物的反应性，最终增加CML和CEL含量。

但重度氧化（L）时，CML含量继续增加（795.98 ng/g），CEL含量却下降（1253.47 ng/g），这表明过度氧化诱导蛋白质聚集，空间位阻阻碍AGEs形成位点（赖氨酸、精氨酸）的可及性。

2.8 机制分析

基于研究结果，提出氧化MPs通过聚集与修饰影响AGEs形成的机制。由于肌球蛋白是MPs中含量最丰富的蛋白质，且多数AGEs来源于肌球蛋白，因此重点讨论肌球蛋白中AGEs形成：

轻度氧化时，・OH对MPs攻击有限，蛋白质结构变化轻微，肌球蛋白主要通过头部-头部交联形成聚集体；同时头部结构域外蛋白质链暴露于活性氧环境发生羰基化修饰，MHC上氨基酸残基的空间接近性促进羰基-胺缩合反应形成共价交联，进而促进AGEs形成。

中度氧化时，氧化损伤导致蛋白质变性，・OH优先作用于MLC形成二硫键，使蛋白质聚集模式从头部-头部交联转为尾部-尾部交联；蛋白质结构解折叠暴露大量疏水性基团、内源荧光团和游离氨基，增加修饰位点可及性，使羰基化与AGEs相关修饰同时增加。

重度氧化时，肌球蛋白主要形成尾部-尾部交联的聚集体（粒径显著增加，且α-螺旋向β-折叠转变），MLC和部分MHC被埋藏于交联结构内部，聚集体外围的MHC成为・OH攻击的主要目标；这种结构重排增加羰基化合物接近AGEs形成位点的空间位阻，有限的赖氨酸/精氨酸残基优先发生羰基化，最终导致AGEs含量降低。

3 结 论

蛋白质氧化水平的差异会导致MPs聚集模式改变，进而改变修饰分布特征与位点结合选择性。MHC是羰基化与AGEs修饰的主要目标，・OH诱导MLC形成二硫键，使MPs聚集从头部-头部交联转变为尾部-尾部交联。中度氧化使MPs解折叠，暴露反应性基团，促进羰基化与AGEs形成；过度氧化则限制MHC上修饰位点的可及性，使反应更倾向于羰基化而非AGEs（尤其是CEL）生成。

本研究表明，蛋白质氧化通过改变蛋白质聚集与修饰模式，独立调节AGEs形成，这不仅拓展了对AGEs生成途径机制的理解，也为评估肉类加工中的氧化控制标准提供了新视角。但肉类加工过程中蛋白质、脂质、糖类在AGEs形成中的相互作用，仍需未来进一步研究阐明。

精彩图表

Fig. 1. Carbonyl (A) and sulfhydryl (B) contents, FTIR spectra (C), circular dichroism spectra (D), and secondary structural composition (E) of •OH-oxidized MPs. Different letters on the bars indicate significant differences (P < 0.05). The letters on the x-axis represent different concentrations of •OH treatment groups (C = 0 mmol/L, S = 0.1 mmol/L, M = 1 mmol/L, L = 10 mmol/L).

Fig. 2. ANS fluorescence intensity (A), intrinsic fluorescence intensity (B), exposure levels of Trp and Tyr (C), zeta potential (D), average particle size (E), and particle size distribution (F) of •OH-oxidized MPs. Different letters on the bars indicate significant differences (P < 0.05). The letters on the x-axis represent different concentrations of •OH treatment groups (C = 0 mmol/L, S = 0.1 mmol/L, M = 1 mmol/L, L = 10 mmol/L), n = 3.

Fig. 3. Changes in the modification sites of •OH-oxidized MPs. A depicts a stacked bar chart of the number of modifications counted by type of modification, B illustrates a Venn diagram of four types of carbonylation and one type of oxidation modification, and C shows a Venn diagram of five types of AGEs-related modifications. Treatment groups indicate different concentrations of •OH (C = 0 mmol/L, S = 0.1 mmol/L, M = 1 mmol/L, L = 10 mmol/L).

Fig. 4. Protein origin of AGEs-related modifications (A-D) and carbonylation modifications (E-H) under various degrees of oxidation treatment. Only the top five proteins by proportion are listed individually; otherwise, they are categorized as “others” for calculation purposes. In this figure, MHC, MLC, MP, and EF-hand denote myosin heavy chain, myosin light chain, myosin motor domain-containing proteins, and EF-hand domain-containing proteins, respectively.

Fig. 5. Profiles of modifications on the two MHCs. A and B correspond to A0A8B9TVK1 and A0A8B9TTL6, respectively. Treatment groups indicate different concentrations of •OH (C = 0 mmol/L, S = 0.1 mmol/L, M = 1 mmol/L, L = 10 mmol/L).

Fig. 6. Spatial distribution of modifications on A0A8B9TVK1 (A-D) and A0A8B9TTL6 (E-H). Carbonylation modifications are marked in red, AGEs-related modifications in yellow, and co-occurrence of both modifications in blue. Treatment groups indicate different concentrations of •OH (C = 0 mmol/L, S = 0.1 mmol/L, M = 1 mmol/L, L = 10 mmol/L).

Fig. 7. Levels of CML (A) and CEL (B) in the •OH-MPs oxidation system. Different letters on the bars indicate significant differences (P < 0.05). The letters on the x-axis represent different concentrations of •OH treatment groups (C = 0 mmol/L, S = 0.1 mmol/L, M = 1 mmol/L, L = 10 mmol/L).

Fig. 8. Mechanism by which oxidized MPs change AGEs levels via aggregation and modification.

专家介绍

黄明 教授

南京农业大学食品科学技术学院

南京农业大学教授、博士生导师、黄教授品牌创始人。国家重点研发计划首席科学家，兼任国家肉鸡产业技术体系执行专家组成员、国际标准化组织（ISO/TC34/SC6）工作组专家、全国屠宰加工标准技术委员会委员、全国畜牧业标准化技术委员会委员，《Food Science of Animal Products》和《肉类研究》科学主编，国家禽肉加工技术研发专业中心主任、国家肉鸡产业技术体系溧水综合试验站站长、江苏省畜禽产品加工工程技术研究中心主任、南京肉制品加工产业创新中心主任等。

主持“十四五”国家重点研发计划项目，国家自然科学基金、江苏省重点研发计划等国家和省部级课题30余项。在国内外学术刊物上发表论文200余篇，主参编著作9 部，制修订标准13 项，获授权专利30余件。创立的产学研一体化技术转化模式入选中国高校产学研合作十大优秀案例。以第一完成人获神农中华农业科技奖一等奖，全国农牧渔业丰收奖农业技术推广贡献奖，中国轻工业联合会科技进步奖一等奖，全国商业科技进步奖特等奖，南京市市长质量奖等6 项。以主要完成人获国家科技进步奖二等奖等国家和省部级奖励5 项。

入选国家万人计划领军人才、国家神农领军英才、泰山产业创新领军人才、南京市科技顶尖专家等人才计划。获全国农村创业创新优秀带头人，教育部全国万名优秀创新创业导师，江苏省“送科技下乡促农民增收”优秀科技特派员等荣誉称号。

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