FSHW | 副干酪乳杆菌S-NB免疫调节作用的分子机制:受胞外多糖生物合成关键基因wze和wzd的调控

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Introduction

乳酸菌因具有免疫调节功效、抗肿瘤活性、抑制致病菌生长、调节肠道和代谢健康等益生作用得到充分的关注和研究，在食品、医疗、化妆品和制药行业已得到广泛应用，在生物技术和健康科学领域也具有广阔的应用前景。

乳酸菌分泌的胞外代谢产物，如胞外多糖（EPS）、细菌素、有机酸等，对宿主健康具有正向调节作用。其中EPS是细菌分泌到胞外或附着在细胞壁上的一类大分子聚合物。近年来，EPS因其安全、稳定的理化性质，以及对人体健康的促进作用受到广泛关注。另外，乳酸菌EPS通过调节NF-κB/MAPK等信号通路，刺激肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、白细胞介素-6 (IL-6)、白细胞介素-12 (IL-12)、诱导型一氧化氮合酶(iINOS)等炎症细胞因子的释放发挥免疫调节作用。

EPS的合成路径复杂，涉及染色体DNA和内源性质粒上的多种编码蛋白，链球菌、乳杆菌、乳球菌等多数乳酸菌依赖于Wzx/Wzy途径合成EPS。EPS的生物合成涉及单糖和双糖硫酸化和转运、单糖重复单元的组装、糖基转移酶和重复单元合成、多糖长链的聚合和转运等，EPS的合成和高级结构依赖于特定基因簇中多个基因的协同作用。目前关于EPS的生物合成对菌株的益生功效之间的内在联系与机制尚不清晰。

南京农业大学食品科技学院李伟教授团队在前期的研究中对副干酪乳酪杆菌S-NB的EPS合成基因簇进行分析，并构建了系列单基因缺失突变株，发现EPS的生物合成与副干酪乳酪杆菌S-NB菌株表型和理化性质关系密切，因此在本研究中构建了胞外多糖合成关键基因wze和wzd缺失突变株，并对野生型菌株、突变株以及胞外多糖组分的免疫调节活性进行评价和机制研究。

图1 EPS合成关键基因wze和wzd对副干酪乳酪杆菌S-NB免疫调节作用的影响

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Results and Discussion

经基因簇比对分析和前期研究结果分析，确定wze和wzd为副干酪乳酪杆菌S-NB的胞外多糖合成关键基因，基因Cre-lox同源重组双交换系统构建关键基因缺失突变株。首先通过反向PCR扩增、一步克隆等技术获得带有氯霉素筛选标记和lox66，lox71位点的敲除载体，经电击转化进入S-NB感受态细胞，筛选出具备氯霉素抗性的阳性转化子；进一步将pMSPCre质粒转化至阳性转化子中，在Cre重组酶的作用下完成氯霉素抗性基因的去除，获得S-NB△7576突变株。

图2 副干酪乳酪杆菌S-NB的EPS合成关键基因缺失突变株的构建

NF-κB和MAPK家族会被一系列细胞外的刺激信号激活并介导信号传导，为研究副干酪乳酪杆菌S-NB的免疫调节作用机制，采用Western Blot检测NF-κB和MAPK通路中主要蛋白的表达水平。与未处理组相比，LPS显著上调了MAPK通路中JNK、p38和ERK的磷酸化水平，而多糖组分BEPS1和BEPS2的干预明显抑制了JNK和p38的磷酸化水平。p65的磷酸化也出现了类似的趋势，表明NF-κB信号通路的激活被减弱。S-NB△7576突变株在与200 μg/mL的BEPS1和BEPS2共同干预后，进一步降低了p-p65和JNK的磷酸化水平。研究结果表明EPS的生物合成与副干酪乳酪杆菌S-NB的免疫调节作用关系密切，多糖组分BEPS1和BEPS2可通过抑制NF-κB和MAPK通路的激活来缓解LPS诱导的炎症。

图3 副干酪乳酪杆菌S-NB野生菌、突变株及其衍生多糖对MAPK信号通路的干预作用机制

图4 副干酪乳酪杆菌S-NB野生菌、突变株及其衍生多糖对NF-κB信号通路的干预作用

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Conclusion

副干酪乳酪杆菌S-NB的胞外多糖组分BEPS1和BEPS2能促进RSW264.7细胞NO和TNF-α的释放量，对S-NB菌株胞外多糖合成基因簇的分析表明，wze和wzd是决定多糖聚合和链长的关键基因。借助Cre-lox同源重组双交换技术获得双基因缺失突变株S-NB△7576，两个基因的缺失使得多糖产量降低，但并未改变单糖的组成和比例。进一步研究表明在LPS诱导的炎症模型中，BEPS1和BEPS2的预处理可通过抑制NF-κB和MAPK信号通路信号传导，从而抑制TNF-α, IL-1β, iINOS和COX-2的转录水平。同时，S-NB△7576突变株在补充了BEPS1和BEPS2后对细胞因子的释放和p65及JNK的硫酸化水平的抑制效果更明显。研究结果证实EPS的生物合成在副干酪乳酪杆菌S-NB的免疫调节功效中起着至关重要的作用。

第一作者简介

肖路遥，女，南京农业大学食品微生物实验室，博士在读，导师为李伟教授。研究方向为食品微生物与生物技术；研究领域包括（1）乳酸菌基因编辑技术、新型操作系统构建，工程菌株的开发应用；（2）益生菌、益生元、后生元的免疫活性、肠道益生特性研究；（3）乳酸菌肠道黏附、定殖机制研究。目前已在Food Science and Human Wellness，Food & Function，Food Research International，生物工程学报等国内外期刊上以第一作者身份发表论文8 篇。

通信作者简介

李伟，男，现任南京农业大学食品科技学院副院长，博士生导师。曾赴哈佛大学医学院Department of Medicine-GI/Nutrition/波士顿儿童医院Division Gastroenterology，Hepatology and Nutrition访问学者。长期从事微生物新资源与安全性评价；新型益生元、益生菌、后生元的研究与开发；益生菌胞外多糖功能和活性研究；活性益生菌高密度培养及活性保持技术研究。主持省部级以上项目18 项，其中国家自然科学基金项目5项，江苏省自然科学基金3 项；主持企业横向项目12 项。已在国内外学术期刊发表科研论文128 篇，其中SCI收录96 篇。申请和授权专利6 项。

Molecular mechanism of exopolysaccharide biosynthesis regulated by wze and wzd genes on the immunomodulatory effects of probiotic Lacticaseibacillus paracasei S-NB

Luyao Xiaoa, Qian Yanga, Changliang Zhangb,c, Kai Mab,c, Xiaogan Zhaoa, Xin Ruia,*, Wei Lia,*

a Sanya Institute of Nanjing Agricultural University, College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

b Jiangsu New-Bio Biotechnology Co., Ltd., Jiangyin 214400, China

c Jiangsu Biodep Biotechnology Co., Ltd., Jiangyin 214400, China

*Corresponding authors.

Abstract

The surface macromolecules of probiotic bacteria play crucial roles in modulating immune responses in the host. Exopolysaccharide (EPS) from lactic acid bacteria (LAB) have been widely reported to exhibit immunomodulatory activity. In this study, the EPS biosynthesis gene cluster of Lacticaseibacillus paracasei S-NB was analyzed and a deletion mutant S-NBΔ7576 (two genes S-NB_2175/wze and S-NB_2176/wzd were responsible for the chain length determination and export of EPS) was successfully constructed, resulting a 40.02% decrease in the production of EPS. The deletion of wze and wzd had little effect on the monosaccharide composition and major groups of the two EPS fractions (BEPS1 and BEPS2). Both BEPS1 and BEPS2 could inhibit the transcriptional level of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β), inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) mRNA in RAW 264.7 cells induced by lipopolysaccharide (LPS), and enhance host immune tolerance via suppressing NF-κB and MAPK signaling. Notably, the S-NBΔ7576 mutant supplied with the BEPS1/BEPS2 exhibited more significant inhibition of cytokines production and the phosphorylation of p65 and c-Jun N-terminal kinase (JNK) in LPS-stimulated cells compared with the S-NBΔ7576 mutant alone. Our study provided the immunomodulatory effect of BEPS1 and BEPS2 from L. paracasei S-NB, in which the wze and wzd genes associated with EPS biosynthesis may play an important role.

Reference:

XIAO L Y, YANG Q, ZHANG C L, et al. Molecular mechanism of exopolysaccharide biosynthesis regulated by wze and wzd genes on the immunomodulatory effects of probiotic Lacticaseibacillus paracasei S-NB[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(1): 9250022. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250022.

文章翻译由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意

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