浙江工业大学团队改造大肠杆菌，实现维生素B5高效生产

维生素 B5，又名泛酸，是人体和动物体内不可或缺的微量营养素。从食物中碳水化合物、脂肪的分解供能，到激素、神经递质的合成，都离不开维生素 B5 的参与。日常饮食中，肉类、全谷物、蛋类等食物虽能提供少量维生素 B5，但工业领域对其需求量巨大，仅依靠天然提取远远不够。

长期以来，全球维生素 B5 的工业生产主要依赖化学合成与酶法结合的路线，该方法以石化原料合成的 D-泛醇内酯和 β-丙氨酸为前体。其过程中往往涉及氰化氢等高毒性原料，产物还需通过立体拆分获得具有活性的 D-构型，导致生产工艺复杂、能耗较高，并带来一定的环境负担。

为突破这一生产难题，近日，浙江工业大学柳志强团队发表在 Green Chemistry 上一篇题为“Enhancing vitamin B5 biosynthesis by multimodule optimization and protein engineering”的研究中，研究人员通过系统性的代谢工程策略和蛋白质理性设计，成功构建了一株高效合成维生素 B5 的大肠杆菌工程菌，不仅显著提高了产量，还实现了全生物合成路线的构建，摆脱了对化学合成 β-丙氨酸的依赖，为维生素 B5 的绿色可持续生产提供了关键技术支撑。

研究中，团队的核心思路是通过多模块优化和改造，让代谢流更高效地流向维生素 B5 的合成。在大肠杆菌中，维生素 B5 的合成主要依赖两条平行路径。一条是 R-泛酸途径，与 L-缬氨酸的合成共享初始步骤，关键基因包括 ilvBN、ilvC、ilvD 等；另一条是 β-丙氨酸途径，最终通过 PanC 酶催化的 ATP 依赖反应，与 R-泛酸途径的产物汇合，形成维生素 B5。

图 | 大肠杆菌中维生素 B5 合成的主要代谢通路

研究团队改造第一步是拓宽R-泛酸途径，研究人员利用 CRISPRi 基因干扰技术，对 129 个候选基因进行筛选，最终锁定 11 个对维生素 B5 产量有显著影响的关键基因。通过调控这些基因的表达——比如增强 ilvD、panB 等基因的活性，同时减弱部分竞争途径基因的表达，成功将碳代谢流更多地引向 R-泛酸合成。对 R-泛解酸模块的基因增强实验证实，该策略有效减少了副产物积累并将产量提升了 84%。

第二步是调控中心代谢以优化前体丙酮酸的分配。丙酮酸是大肠杆菌中心代谢的关键节点，它既可以进入三羧酸循环（TCA 循环）为细胞生长供能，也能作为 R-泛酸途径的核心前体，其分配比例直接影响维生素 B5 的合成效率。

为了让更多丙酮酸流向维生素 B5，研究团队对 TCA 循环的关键酶进行改造：比如将柠檬酸合酶的起始密码子从 ATG 改为 GTG，降低其活性，减少丙酮酸进入 TCA 循环的量；同时改造丙酮酸脱氢酶的 E1 亚基，使其对丙酮酸的亲和力下降，进一步“分流”丙酮酸。通过这些改造，丙酮酸的利用率显著提升，维生素 B5 产量随之增加到 6.30 g/L。

第三步是强化一碳单位的供应。维生素 B5 合成过程中需要一碳单位的参与，而一碳代谢的强弱直接影响甲基供应。研究团队通过增强丝氨酸-甘氨酸代谢模块和叶酸合成途径，引入甘氨酸核糖开关动态调控细胞内甘氨酸水平，成功将产量提升至 7.83 g/L。这一策略不仅提高了一碳单位的利用效率，还避免了甘氨酸积累对合成的抑制。

图 | 通过增强丝氨酸-甘氨酸代谢模块，提高一碳单位供应

此外，研究团队对关键酶 AHAIR（乙酰羟酸异构还原酶）进行了理性设计。该酶在维生素 B5 和支链氨基酸合成中具有底物混杂性，导致碳流向异亮氨酸等副产物分流。通过分子对接和动力学模拟，筛选出 A47S 和 V115I 等突变体，显著提高了对 2-乙酰乳酸的特异性，减少了异亮氨酸积累，最终将产量提升至 8.41 g/L。

最终经过多轮优化，工程菌株 DPAC4 在 5 L 生物反应器中展现出良好的生产能力：在添加 β-丙氨酸的情况下，96 小时内维生素 B5 产量达到 148.31 g/L，葡萄糖转化率为 0.43 g/g，生产效率达 1.54 g/(L·h)，这是目前全球报道的最高水平。

图 | 构建了一条不依赖外源添加的β-丙氨酸内源合成路径，最终实现了维生素B5的完全生物合成

但 β-丙氨酸作为外源添加物，会增加生产成本。为了实现全生物合成，团队进一步构建 β-丙氨酸合成模块，通过增强天冬氨酸脱羧酶等关键酶的活性，让大肠杆菌能自主合成 β-丙氨酸。最终菌株 DPAS3 在无需外源添加的情况下，60 小时产量达 65.12 g/L，彻底摆脱了对昂贵原料的依赖。

这项研究不仅为维生素 B5 的绿色生产提供了可行方案，更展示了“多模块代谢工程+蛋白质工程”策略的强大潜力。未来，这套技术思路还可应用于其他维生素、氨基酸等化学品的生物制造，为推动生物化工产业的绿色转型提供重要支撑。

参考文献：

1. https://doi.org/10.1039/D5GC02458G

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