把ADCC的“威力”调小点儿！抗体工程中的LALA技术

LALA 技术是抗体工程中的一个关键方法，主要用于改造抗体的 Fc 区域。Fc 区域是抗体与免疫系统其他组成部分（如补体系统和 Fc 受体）相互作用的部分。LALA 技术通过引入特定的突变来改变 Fc 区域的性质，从而调控抗体的功能。

技术细节

LALA 技术的核心在于对抗体 Fc 区域的两个关键氨基酸残基进行突变：

• Leu234Ala: 将位置 234 的亮氨酸（Leucine, L）突变为丙氨酸（Alanine, A）。

• Leu235Ala: 将位置 235 的亮氨酸（Leucine, L）突变为丙氨酸（Alanine, A）。

这些突变位于 Fc 区域的 CH2 结构域，该结构域负责与 Fcγ 受体（Fc gamma receptors, FcγRs）结合。

FcγRs 是免疫细胞（如巨噬细胞、NK 细胞、中性粒细胞等）表面的受体，能够识别和结合抗体的 Fc 区域，从而触发免疫细胞的效应功能，例如抗体依赖的细胞毒性（ADCC）、抗体依赖的细胞吞噬（ADCP）等。

LALA 技术的作用机制

LALA 突变通过改变 Fc 区域的结构，显著降低了抗体与 FcγRs 的结合能力。这意味着：

• 减少免疫细胞的激活：抗体不再能够有效地激活免疫细胞，减少了由此引发的炎症反应和组织损伤。

• 降低抗体的免疫原性：LALA 突变可以减少抗体被免疫系统识别和清除的可能性，从而延长其在体内的半衰期。

• 减少非特异性结合：降低抗体与非目标细胞的结合，提高其对目标抗原的特异性，从而减少免疫系统副反应，避免损伤血细胞，提升安全性。

历史上关于LALA技术的重要事件

2006年3月13日，六名健康男性在输注实验性抗体TGN1412后出现严重副作用，引发了危及生命的细胞因子风暴，导致部分志愿者永久性伤害。其中，TGN1412是一种针对免疫系统的IgG4抗体，用于治疗白血病和自身免疫性疾病。

科学家们调查后发现，TGN1412靶向T细胞上的CD28抗原，会诱导细胞增殖和炎症性细胞因子释放。它是一种“超级激动剂”，能向T细胞传递强烈信号。人类和食蟹猴CD28表达的差异可能是临床前研究未发现严重不良反应的原因。此外，细胞激活还需要抗体的Fc区参与，Fc受体的作用可能被低估了。由此，人们意识到了Fc功能的重要性，并开发了LALA技术。

抗体各亚型都有哪类Fc受体相结合？

人类有四种IgG抗体亚类，其中IgG1、IgG2和IgG4被用于治疗性抗体。它们与至少三种不同类别的Fcγ受体相互作用，这些受体存在于免疫系统的多种细胞上，并且存在不同的亚型和等位型。

人类Fcγ受体的示意图

其中，IgG1结合能力最强，能够激活所有的人类Fcγ受体；IgG2主要与FcγRIIa相互作用，而IgG4则与FcγRI、FcγRIIa和FcγRIIb相互作用。此外，IgG1与补体成分C1q的结合能力也是最强的，并且能够激活补体依赖性细胞毒性（CDC）。

知识点补充小栈

不同IgG亚型在各方面的差异

结构：IgG1和IgG4的铰链区较短，结构相对稳定；IgG2的铰链区更短，刚性更强；IgG3的铰链区最长，含有额外的二硫键和重复序列，灵活性最高。

不同IgG亚型在分子量方面：IgG1、IgG2、IgG4的分子量约为150 kDa；IgG3约170 kDa。

效应功能

ADCC：IgG1和IgG3与FcγRIIIa（CD16a）结合能力强，ADCC效应显著；IgG2和IgG4的ADCC效应较弱。

CDC：IgG1和IgG3与C1q结合能力强，CDC效应显著；IgG2的CDC效应较弱，IgG4几乎无CDC效应。

半衰期：IgG1、IgG2、IgG4的半衰期较长（约21天），因其与新生儿Fc受体（FcRn）结合能力强；IgG3的半衰期较短（约7天），因其与FcRn结合能力较弱。

生物学特性

IgG1：最常见的治疗性抗体亚型，兼具强ADCC和CDC效应，用于抗肿瘤、抗感染及自身免疫病治疗（如利妥昔单抗、曲妥珠单抗）。

IgG2：ADCC和CDC效应较弱，但稳定性高，适合靶向细菌多糖抗原（如肺炎球菌疫苗），在抗炎和抗感染中应用较多。

IgG3：ADCC和CDC效应最强，但半衰期短且易聚集，临床应用较少，主要用于研究或特定感染性疾病（如疟疾）。

IgG4：ADCC和CDC效应最弱，但抗炎作用显著，适合需要减少免疫激活的场景，用于过敏性疾病治疗（如奥马珠单抗）或双特异性抗体设计。

弱化ADCC效应能力，除了IgG4，IgG2是否可以成为一种选择呢？

IgG2因其较低的FcγR结合活性而具有“沉默”特性，但其二硫键交换导致的异质性和较短的半衰期限制了其应用。一种由IgG2的CH1结构域和铰链区与IgG4的CH2和CH3结构域组成的嵌合抗体比单独使用IgG2或IgG4更具“沉默”特性。这种构建体已被用于4个INN药物中，其中两种已获得市场授权，它们是依库珠单抗（eculizumab）和拉武利珠单抗（ravulizumab）。

其他弱化ADCC的技术方法

除此之外，还有其他弱化ADCC效应的手段。部分内容已在之前的文章中有所提及。

• 无糖基化抗体通过去除Fc区域的N-连接糖基化位点，显著降低了FcγR结合和免疫激活效应，但仍存在部分残留活性。尽管在临床试验中显示出一定的潜力，但其生产难度和稳定性问题限制了其广泛应用。双特异性T细胞接合剂（如mosunetuzumab和tarlatamab）尽管经过无糖基化改造，仍可能引发严重的CRS，表明无糖基化并不能完全消除炎症反应。

  
  

• 通过下铰链区突变（如L235E）来实现Fc沉默，也是减少抗体与FcγR结合的有效策略。尽管这类突变显著降低了免疫激活效应，但仍可能引发输注相关反应。

• 通过亚型间残基交换（如E233P/L234V/L235A）和组合突变（如D265A），研究人员开发了更有效的Fc沉默抗体。尽管这些变体显著降低了FcγR活性，但仍存在热稳定性降低和半衰期缩短等问题。

LALA家族

迄今为止，下铰链区组合变体中使用最广泛的是IgG1的L234A/L235A突变，通常称为“LALA”。该突变完全消除了补体活性，并将与FcγRI和FcγRII的结合降低了100倍。而F234A/L235A仍然是IgG4中最受欢迎的变体。

LALA家族的扩展

尽管LALA变体广受欢迎，但IgG1的LALA变体并未完全沉默。它们显示出与可溶性FcγRI和FcγRIIIa的158V等位基因的显著结合，以及与除FcγRIIIa的158F等位基因外的所有受体的高水平ADCP（抗体依赖性细胞吞噬作用）和ADCC（抗体依赖性细胞毒性）。此外，与野生型IgG1相比，突变的CH2结构域热稳定性降低。因此，一些研究人员添加了额外的突变以使沉默更完全，并可能恢复热稳定性。

• 最早的方法之一是在下铰链区添加额外突变，创建L234A/L235A/G237A变体。该变体成功消除了与FcγRI和FcγRIII的结合，并恢复了热稳定性，但矛盾的是，它增加了与FcγRIIa的131H等位基因和FcγRIIb的细胞激活。

• 之后，由研究人员将L234A/L235A/G237A与N297A结合。通过在下铰链区添加突变到无糖基化抗体中，Fc效应功能被完全消除，但代价是稳定性和聚集潜力显著降低。

• 2000年和2001年，人类IgG1 Fc与FcγRIII可溶性结构域复合物的晶体结构被发表。P329作为一个广泛保守且重要的接触残基的鉴定，促使研究人员探索其提供更完全沉默的潜力。单点突变P329A或P329G消除了与C1q的结合，并将与所有Fc受体的结合降低了一个数量级。LALA与P329G的组合几乎完全消除了与Fcγ受体的结合，且未检测到ADCC。而LALA与P329A的组合效果较差。近年来，L234A/L235A/P329G变得越来越受欢迎。

LALA家族的更多远亲

• 一种包含L235A/G237A突变的抗体在很大程度上消除了与FcγRI、FcγRIIIa和FcγRIIa的131R等位基因的结合，但仍保留了与131H等位基因和FcγRIIb的ADCP（抗体依赖性细胞吞噬作用）活性。

• 有研究人员将L234F/L235E突变与P331S突变结合，但其表现不如其他变体，与所有这些受体结合时仍显示出可测量的ADCP和ADCC水平，且热稳定性降低。

• L234F/L235E还可与D265A结合，应用该技术的抗体药物附有CRS风险的黑框警告，51%的患者出现了CRS。L234F/L235E/D265A比L234F/L235E/P331S更完全沉默，但与野生型IgG1相比，热稳定性降低。

其他变体

通过结合多种突变（D265A/P331S和L235R/G236R/S239K/A327G/A330S/P331S），研究人员开发了更有效的Fc沉默抗体。尽管这些变体显著降低了FcγR结合和补体活性，但仍可能存在残留的ADCP活性。

一种具有更优特性的新变体

下铰链区是Fc沉默最常见的靶向位点，但许多改变会损害热稳定性。它也是对基质金属蛋白酶（MMP）降解最敏感的区域，可能导致生物活性丧失。

通过将234和235位点突变与G236R结合，研究人员发现了一组在所有结合或功能测定中完全沉默的变体——甚至超越了之前可用的变体，如L234A/L235A/P327G。其中最好的之一是L234S/L235T/G236R（“STR”）。它不仅完全沉默，其热稳定性至少与野生型IgG相当（甚至更好），并且对基质金属蛋白酶的抵抗力也更强。世界卫生组织已将该变体采纳为Fc沉默的“金标准”。它不仅对人类IgG1有效，还对所有人类亚型以及小鼠、兔子和猴子的IgG有效，并能有效沉默与这些不同物种Fc受体的结合，使其在临床前和临床研究中特别有用。

Fc修饰是否会带来免疫原性？

众所周知，免疫球蛋白恒定区的单点突变可能具有免疫原性。尽管Fc修饰可能引发抗药抗体反应，但现有研究表明，大多数Fc沉默突变（如LALA和STR）在临床应用中未显示出显著的免疫原性。然而，许多其他因素也会影响免疫原性风险，例如聚集。因此，通过计算机模拟和体外方法评估突变风险，并结合差示扫描荧光法（DSF）筛选变体，可以进一步降低免疫原性风险。

使用哪种变体？

熟悉的“LALA”变体在与所有人类Fcγ受体的ADCP和ADCC中仍然具有活性。大多数其他变体以及野生型IgG2和IgG4具有与野生型IgG1相似的FcγRI和/或FcγRII受体的ADCP活性。只有两种变体在所有功能测定中完全沉默：IgG1 L234A/L235A/P329G和IgG4 E233P/F234V/L235A/D265A。不幸的是，与野生型IgG1相比，这两种变体的热稳定性显著降低，大多数其他变体也是如此，特别是缺乏Fc糖基化的N297A和N297G。沉默的必要程度取决于多种因素：临床适应症、抗体形式、靶抗原、剂量、给药途径等。

我们能从抗PD-1和抗PD-L1抗体中学到什么？

实验表明，与Fcγ受体的结合会削弱抗PD-1抗体的抗肿瘤活性，但会增强抗PD-L1抗体的抗肿瘤活性。

通过直接比较一种具有野生型IgG4 Fc（可结合FcγRI和FcγRII）的抗PD-1抗体和一种具有E233P/F234V/L235A/D265A突变（完全沉默结合）的抗PD-1抗体。沉默抗体在体外表现出阻断活性，而野生型抗体则具有激活作用。

抗体学会列出了18种已获批用于临床或正在接受监管审查的抗PD-1抗体。其中包括四种具有“沉默”突变的IgG1（LALA或LALA加G237A），13种野生型IgG4（带有S228P以稳定结构）和替雷利珠单抗。

在这一免疫检查点轴的另一端，抗体学会列出了10种已获批或正在审查的抗PD-L1抗体。其中包括四种野生型IgG1，一种野生型IgG4和五种不同的Fc变体。

其他免疫刺激性抗体

除了PD-1和PD-L1，其他还有针对CD47、CD40和4-1BB等的抗体。对于像PD-1或LAG-3这样的抑制性受体，选择完全Fc沉默的拮抗剂是一种趋势。

ADC与LALA技术

据估计，ADC通常只有大约0.1%被肿瘤吸收——其余的ADC去了哪里？严重的副作用，包括淋巴细胞减少症、中性粒细胞减少症、血小板减少症和神经病变，在所有ADC中都很常见。至少其中一些非靶向效应可能是由Fcγ和/或FcRn受体介导的细胞摄取引起的，而Fc沉默将提供更可靠的解决方案。

总结

很多时候，选择缺乏科学依据，知识产权是重要的影响因素之一。Fc修饰的专利格局复杂，截至2019年，IgG4抗体专利被总结，其他亚类未有类似分析。LALA家族中有效沉默突变（如L234A/L235A/P329G、L234F/L235E/D265A）专有，使用受限于所有者，其他变体专利申请仍在进行。这可能促使一些人探索Fc领域的奇特区域。STR变体可能已达到既完全又不损害Fc区域结构完整性的Fcγ沉默极限，但抗体工程研究人员仍有很大发挥空间。

总之，LALA 技术是一种重要的抗体工程方法，通过对 Fc 区域的精准改造，调控抗体的免疫功能。它在提高抗体药物的安全性、有效性和特异性方面发挥着关键作用，为治疗多种疾病提供了新的可能性。

参考资料|DOI: 10.1111/imr.13379

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