《食品科学》：甘肃农业大学祝霞教授等：多菌种酵母混菌乙醇发酵特性分析

现代葡萄酒酿造中通常采用发酵彻底、乙醇转化率高的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行乙醇发酵。但单一酵母的使用会导致葡萄酒风格特征不明显，风味同质化严重，无法满足消费者的多元化需求。已有研究表明，在葡萄酒/果酒自然乙醇发酵早期，源自果皮的非酿酒酵母（NS）菌群对酒体风味品质形成具有重要影响。但由于野生菌株的未知和复杂性，使自然发酵结果难以预测和控制。为了充分呈现优良NS菌株显著的芳香多样性，可将优选菌株分别与S. cerevisiae组成顺序接种混合发酵剂，不仅能够促进酯类、高级醇、硫化物和萜烯类化合物等香气物质的合成和释放，同时还可以降低乙醇含量，丰富葡萄酒/果酒的风味多样性。

然而不同种属的NS菌株在酿酒应用时也各有不足，因此亟需进一步改进酵母混合发酵剂组合，最大限度发挥NS菌株对发酵酒样感官特性的改善效果。

甘肃农业大学食品科学与工程学院的王媛、臧亚杰、祝霞*等人将高产糖苷酶的本土T. delbrueckii、M. pulcherrima和H. uvarum两两组合共接种，分别与S. cerevisiae顺序接种进行乙醇发酵，测定模拟葡萄汁发酵过程中的动力学变化和挥发性香气化合物差异，优选最佳接种菌株组合，以期为多菌种混合发酵剂开发提供科学参考。

1 发酵动力学分析

1.1 还原糖质量浓度和乙醇体积分数

不同接种处理组模拟葡萄汁乙醇发酵过程中还原糖质量浓度和乙醇体积分数变化见图1。VW组在第10天完成乙醇发酵（图1A），而NS参与的6 个处理组均在第12天结束发酵。如图1B所示，各个处理组的乙醇体积分数均呈上升趋势，但略有波动。最终VW组酒样的乙醇体积分数明显高于其他处理酒样。

1.2酵母生物量

不同NS菌株与VW顺序接种发酵过程中菌株生物量变化如图2所示。3 株NS菌株两两组合分别与VW进行顺序发酵时，发酵初期NS菌株生长较快。Td参与混菌发酵时，HTV处理组的Td生物量在第3天达到最大值（1.82×107 CFU/mL）；TV和TMV组的Td生物量均在第2天达到最大值（分别为7.50×106 CFU/mL和1.06×107 CFU/mL），在发酵第8天未能检测到Td。Mp参与混菌发酵时，HMV组的Mp生物量在发酵过程中显著高于MV和TMV组。VW接入后乙醇体积分数迅速增加，Mp菌株生物量快速下降。MV和TMV组中Mp衰亡时间早于HMV组。Hu参与的发酵处理中，每个处理的Hu菌株均保持较高的活性；在HMV组中，Mp和Hu的加入促进了彼此之间的生长，对其最大生物量也有一定的影响。HMV组的Hu最大生物量高于HV和HTV处理，其中Hu的生物量在第2天达到最大值，为1.77×107 CFU/mL。

VW菌株在纯种发酵、单一NS接种组和双NS处理组中均表现出较高的生长活力。值得注意的是，虽然各处理组的VW最大生物量均约为7.80×107 CFU/mL，但NS参与的处理组中接入VW后仅需2～3 d即可达到最大生物量。此外，相对于VW纯种发酵（10 d），其余6 个处理组均先接种NS后48 h再接种VW，需要12 d才能完成乙醇发酵。这进一步证明NS菌株的耗糖能力弱，发酵速率较慢；另一方面则表明NS菌株对后续接入的VW菌株定植有一定促进作用。

2 基本理化指标分析

如表1所示，各处理组的还原糖质量浓度均小于4.00 g/L且各组之间无显著差异（P＞0.05）。所有酒样的乙醇体积分数在12.02%～12.63%之间，VW组的乙醇体积分数最高（12.63%），且NS组合＋VW组（TMV、HTV和HMV）的乙醇体积分数整体低于单一NS＋VW组（TV、MV和HV）。其中HMV组的乙醇体积分数最低（12.02%）。与VW组相比，NS组合＋VW组和单一NS＋VW组的甘油质量浓度均有所增加，pH值极显著上升（P＜0.01），总酸质量浓度极显著下降（P＜0.01）。挥发酸质量浓度在0.53～0.60 g/L之间，其中VW组最高（0.60 g/L）。

3 挥发性发酵香气化合物分析

3.1 挥发性发酵香气化合物种类和质量浓度

各组酒样共检测出62 种挥发性发酵香气化合物，包括高级醇类14 种、酯类27 种、脂肪酸11 种、苯衍生物2 种、羰基化合物7 种和挥发性酚1 种。NS参与发酵的酒样中挥发性化合物种类高于VW组（图3A）。图3B直观显示了不同类别挥发性化合物的质量浓度，弦线越粗表示对应的化合物质量浓度越大。与VW组（6 609.44 μg/L）和单一NS＋VW组（TV：6 888.95 μg/L；MV：6 956.13 μg/L；HV：8 697.02 μg/L）相比，NS组合＋VW组中挥发性化合物总质量浓度极显著增加（P＜0.01），其中HMV组挥发性化合物质量浓度最高（12 467.18 μg/L）。结果表明，NS两两组合共接种发酵对酒样中挥发性化合物质量浓度具有显著影响。

3.2 挥发性发酵香气化合物聚类分析

高级醇是酵母乙醇发酵过程中形成的重要挥发性化合物，对香气复杂性具有很大的贡献。HMV组中检测到的高级醇质量浓度最高（4 317.39 µg/L），明显高于VW组（3 349.92 µg/L）（P＜0.01）（图4A）。特别是NS参与发酵的处理组中异丁醇、异戊醇、正戊醇、正庚醇、苯乙醇和正辛醇质量浓度均提高。异戊醇是所有酒样中质量浓度最高的高级醇，其在单一NS＋VW组（TV：2 781.92 µg/L；MV：2 743.01 µg/L；HV：3 101.54 µg/L）的质量浓度均显著低于NS组合＋VW组（TMV：3 408.23 µg/L；HMV：4 317.39 µg/L；HTV：3 556.31 µg/L）（P＜0.05）。

本研究共检测到27 种酯类化合物（脂肪酸乙酯14 种、乙酸酯5 种、其他酯8 种），总质量浓度在2 709.34～7 312.69 μg/L之间（图4B）。在单一NS＋VW组中，与TV和MV组相比，HV组酒样具有更高质量浓度的乙酸庚酯、乙酸辛酯、乙酸苯乙酯和乙酸异戊酯。而2 种NS菌株Mp和Hu的共接种组合（HMV）则进一步增加了乙酸酯的质量浓度，尤其是乙酸乙酯相比于MV、HV组分别增加87.88%和33.00%。TV处理的酒样中乙酸乙酯质量浓度与VW组无显著差异（P＞0.05），但是当Td菌株与其他NS菌株共接种时（HTV和TMV），乙酸乙酯质量浓度显著高于VW纯种发酵和TV处理，表明同时接种2 种NS与VW进行顺序发酵可以显著增加乙酸酯类化合物质量浓度（P＜0.01）。

HMV组中的脂肪酸乙酯总量比HV组增加约41.70%，其中辛酸乙酯增加了33.00%；而HTV组中的脂肪酸乙酯总量比HV组少6.23%，这与HV组含有更多的辛酸乙酯、癸酸乙酯和反-4-癸烯酸乙酯相关（图4C），说明2 种NS共接种显著影响了脂肪酸乙酯的产生。与此同时，当2 种NS共接种时检测到较高质量浓度的3-甲基丁酸乙酯，而在纯种发酵（VW）和单一NS＋VW组（TV、MV和HV）中未检测到。说明多种微生物之间相互作用产生新的挥发性香气化合物，有助于增加酒样的香气浓郁度。

除了乙酸酯和脂肪酸乙酯外，本研究还检测到8 种其他酯（图4D）。无论是单一NS＋VW组（TV、MV和HV）还是NS组合＋VW组（TMV、HTV和HMV）中，其他酯类化合物的质量浓度均高于VW组。特别是HMV组中辛酸异戊酯和癸酸异戊酯质量浓度是VW组的3.11 倍和4.16 倍，分别是MV和HV组的2.44、2.01 倍和2.61、2.43 倍。

酒样中共检测出11 种脂肪酸类物质（图4E），其中单一NS＋VW组（TV、MV和HV）的脂肪酸质量浓度高于VW组，而NS组合＋VW组的脂肪酸质量浓度极显著高于单一NS＋VW组（P＜0.01）。2 种NS共接种处理酒样中，HMV组酒样产生的异丁酸、正己酸、辛酸、正壬酸、正癸酸、9-癸烯酸和月桂酸质量浓度均高于TMV和HTV组，而HTV组的α-酮戊二酸产量最高，分别比TMV和HMV组高17.12%和42.78%。

醛类、酮类、苯衍生物和酚类化合物尽管质量浓度相对较低，但它们对葡萄酒/果酒的整体香气特征也具有一定影响。本研究中6 组混菌发酵处理的苯衍生物质量浓度均高于VW组（图4F）。其中HMV组的苯乙酸乙酯质量浓度最高，TMV组的苯乙烯质量浓度最高。在所有处理中，HMV组酒样产生的酮类化合物（2-壬酮和甲基庚烯酮）质量浓度极显著高于其他组（P＜0.01）。作为乙醇发酵的副产物，适量的醛类化合物能增强酒样的香气，使酒体风味更加均衡。与VW组和单一NS＋VW组（TV、MV和HV）相比，HMV组酒样中的醛类化合物，尤其是正壬醛质量浓度极显著增加（P＜0.01）。

3.3 挥发性化合物的主成分分析（PCA）

如图5A所示，PC1和PC2方差贡献率分别为65.3%和14.2%，前2 个主成分可以解释总方差的79.5%。所有处理通过PC1均能分离，VW和单一NS＋VW组（HV、TV和MV）分布在PC1的负半轴，TMV、HTV和HMV组分布在PC1的正半轴。其中TMV和HTV组与乙酸酯、羰基化合物和酚类的相关性较强，HMV与高级醇、脂肪酸乙酯、脂肪酸、苯衍生物和其他酯相关性较强。综上所述，与VW组和单一NS＋VW组相比，NS组合＋VW组尤其是HMV处理能够显著提高挥发性化合物质量浓度。

OAV＞1的化合物被认为是主要的风味贡献者，而OAV在0.1～1范围内，表明该化合物可能通过协同、抑制作用或基质效应影响果酒的香气。为了更直观地呈现不同处理组关键挥发性香气化合物的差异，将OAV＞0.1的16 种化合物进行PCA。由图5B可知，除MV和TV组分布距离较近外，其余各处理之间分布距离较远。且所有处理均可通过PC1进行分离。TV、MV和HV组分布在PC1负半轴。HMV组与辛酸乙酯、壬酸乙酯、癸酸乙酯、异戊醇、辛酸乙酯、辛酸、己酸和癸酸聚集在一起（PC1正半轴），表明以上化合物与NS组合共接种发酵具有强相关性。HTV和TMV组位于第1象限，与正辛醇和正癸酸的生成呈强相关，这两种挥发性化合物可能赋予酒样柑橘、玫瑰和柠檬的香气特征。

3.4 不同处理酒样中主要挥发性化合物的香气特征分析

OAV＞0.1的香气化合物可以通过协同和累加等相互作用，呈现发酵酒样的香气属性。参考杨柳等的方法，将各组OAV＞0.1的挥发性化合物分为果香、甜香、苹果、香蕉、生青味、脂肪味和花香7 个香气属性特征。通过累加具有相似香气特征化合物的OAV，得出不同接种方式下酒样的香气雷达图（图6）。果香和花香是本实验酒样的主要香气特征，HMV组酒样中果香、甜香、香蕉和苹果香气特征更加突出，乙酸异戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯和癸酸乙酯为主要贡献者；TMV组酒样中呈现生青味香气特征的化合物质量浓度较高，其主要贡献者为正壬醛和癸醛；HV组酒样的脂肪味属性相对较多；而所有组的甜香特征无显著差异。以上结果说明NS双菌种共发酵对酒样特征香气物质的生成具有积极影响，需要进一步明确它们之间的关键挥发性化合物差异。

3.5 关键挥发性差异化合物分析

以NS组合＋VW组（TMV、HTV和HMV）作为自变量，OAV＞0.1的16 种挥发性香气化合物作为因变量，通过OPLS-DA可以实现NS组合＋VW组内酒样的有效区分（图7A）。结合OAV（OAV＞0.1）和变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1分析可知，辛酸乙酯、异戊醇、癸酸乙酯、己酸乙酯和辛酸是NS组合＋VW组内之间相互区分的关键差异化合物（图7B）。此外，HMV组中所有关键挥发性差异物质量浓度极显著高于HTV和TMV组（P＜0.01），表明本土Hu和Mp组合共接种与S. cerevisiae顺序发酵对提高酒样的果香和花香特征具有明显的效果。

以不同处理组（VW、MV、HV和HMV）作为自变量，以相应酒样中16 种挥发性香气化合物（OAV＞0.1）作为因变量，通过OPLS-DA也可以实现对4 个酒样的有效区分（图8A）。VIP＞1的3 种酯类、1 种高级醇和2 种挥发性脂肪酸可作为这4 个处理组之间相互区分的主要特征标志物。由图8B可知，单一NS＋VW组（MV和HV）酒样中大部分VIP＞1的香气化合物质量浓度显著高于VW组酒样，HMV组酒样的各关键差异化合物质量浓度均为最高，具有显著提升酒样的香蕉、苹果等果香特征的潜力。

4 讨论

4.1 多菌种发酵对不同处理酒样生物量的影响

本研究中S. cerevisiae在纯种发酵、单一NS处理组和双NS菌株共接种组中均达到相似的最大生物量，表明1 种及以上的NS参与乙醇发酵并不明显影响S. cerevisiae主导乙醇发酵，与Nissen等的结果一致。不同发酵处理中，NS的生物量均表现出先上升后下降的趋势，但其最大生物量不同且达到最大生物量的时间存在差异。其中HMV组中M. pulcherrima的最大生物量高于MV处理，这一方面可能因为葡萄汁生境适应性最强的H. uvarum代谢产物促进了M. pulcherrima的生长。另一方面也与H. uvarum和M. pulcherrima酵母细胞间接触涉及类似受体/配体形式的相互作用，改善了M. pulcherrima的生长活性有关。

4.2 多菌种发酵对不同处理酒样理化指标的影响

已有研究发现，部分NS菌株可以降低乙醇含量，例如M. pulcherrima、H. uvarum和T. delbrueckii等。本研究中NS参与的处理中乙醇体积分数相比VW组均有所降低，且NS组合处理组比单一接种NS处理组的乙醇体积分数降低幅度大，特别是共接种H. uvarum和M. pulcherrima表现出一定的低产乙醇潜力。其原因可能是部分还原糖被转变为甘油、琥珀酸和乳酸等副产物。本研究中所有NS参与发酵的酒样甘油质量浓度普遍高于VW组，其中HMV组的甘油质量浓度最高（6.13 g/L），与其较低的乙醇体积分数相符合。有研究表明，当甘油质量浓度超过5.2 g/L时，可赋予发酵酒样甜味和柔和度，有助于提升酒体风味，这与本研究结果相似。此外，共接种H. uvarum和M. pulcherrima与S. cerevisiae进行发酵的酒样总酸质量浓度为6.17 g/L，明显低于VW组酒样（6.95 g/L）。酒样中检测到挥发酸质量浓度均在0.2～0.7 g/L的范围内，可以通过与其他风味化合物的相互作用丰富酒体的风味。

4.3 多菌种发酵对不同处理酒样挥发性化合物的影响

本实验接种M. pulcherrima、H. uvarum和S. cerevisiae进行多菌种发酵时，大多数挥发性化合物如高级醇、酯类和脂肪酸等的质量浓度与VW组和单一接种NS组相比显著增加（P＜0.05），明显提高了酒样的花果香和香气复杂性。NS组合处理组中的高级醇质量浓度显著高于单一接种NS组（P＜0.05），这可能是由于接种2 种不同的NS菌株增加了酵母菌群的多样性，从而提高了酒样的高级醇质量浓度。此外，异戊醇是所有酒样含量最高的高级醇，特别是HMV组中异戊醇质量浓度显著高于TMV和HTV组，可能是H. uvarum和M. pulcherrima之间具有良好的协同作用，提高了Ehrlich途径代谢水平，促进了异戊醇的合成。

S. cerevisiae与NS混菌发酵可以通过调节乙酸酯、脂肪酸乙酯和其他酯类化合物的合成增强酒体的花香和果香。本研究中HV处理相较于TV和MV处理，显著提高了乙酸乙酯和乙酸苯乙酯质量浓度，这与H. uvarum既具有较高的乙酸乙酯合成能力，也是乙酸苯乙酯有效生产者的结论相印证。与此同时，H. uvarum和M. pulcherrima共接种后酒样的乙酸乙酯和乙酸苯乙酯质量浓度进一步增加，这表明多菌种发酵对挥发性成分具有一定累加效应。

此外，HMV组的脂肪酸乙酯总质量浓度最高，特别是辛酸乙酯、癸酸乙酯和己酸乙酯等挥发性化合物贡献较大。辛酸作为辛酸乙酯的合成底物，是HMV组中质量浓度最高的挥发性脂肪酸化合物，这可能与生物酶介导的辛酸与乙醇的酯化作用及其在酵母细胞壁中的吸收有关。挥发性脂肪酸不仅决定着发酵饮料的风味特征，而且影响脂肪酸乙酯的生物合成。Hu Kai等研究发现，H. uvarum显著影响了赤霞珠葡萄酒顺序发酵过程中乙酸、乙酯和脂肪酸等挥发性化合物的增香效果。另有研究报道，M. pulcherrima是高产果香酯的菌株，其产生的辛酸乙酯能够增强与菠萝相关的果香味。本研究中，M. pulcherrima、H. uvarum与S. cerevisiae混菌发酵能够明显增强辛酸乙酯的质量浓度，进一步说明共接种M. pulcherrima和H. uvarum发酵可能一方面会通过叠加效应促进有益风味化合物的积累，另一方面会相互作用调节其他酵母的代谢性能，从而最终改变发酵产物的风味特征。

结论

本研究采用3 株优选本土NS菌株进行两两组合与S. cerevisiae顺序接种于模拟葡萄汁，并对多菌种发酵酒样的酿酒学参数和挥发性物质进行分析。结果表明，NS组合处理组不仅有效降低乙醇体积分数，增加甘油质量浓度，而且显著提高了发酵酒样的香气复杂性，花香和香蕉、苹果等果香特征突出。通过OPLS-DA结合OAV明确了HMV组区分其他处理组的关键差异风味物质，可为酿酒师提供更科学的发酵剂选择依据。综合分析，M. pulcherrima、H. uvarum和S. cerevisiae混菌发酵是丰富酒样香气化合物的有效方法，可以进一步应用于葡萄酒酿酒生产实践。

本文《多菌种酵母混菌乙醇发酵特性分析》来源于《食品科学》2025年46卷第14期93-102页，作者：王媛，臧亚杰，徐彬艳，杨学山，祝霞。DOI:X10.7506 / spkx1002-6630-20241224-198。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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