药学1区5.4分: 上海中医药大学等以多组学揭示复元醒脑汤治疗脑梗死的作用机制

本期推荐的是由上海中医药大学龙华医院急诊科、上海中医药大学急危重症研究所、浙江中医药大学第二附属医院急诊科、浙江中医药大学第一附属医院重症监护室、天津中医药大学等研究团队合作近期发表于Journal of ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，多组学揭示复元醒脑汤通过肠道菌群和JAK2 - STAT3通路治疗脑梗死的作用机制。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

Multi-omics Reveals Fuyuan Xingnao Decoction's Therapeutic Mechanism in Cerebral Infararction via Gut Microbiota and JAK2-STAT3 Pathway

民族药理学相关性

脑梗死是一种脑血管疾病，其特征是血管闭塞导致脑组织缺血缺氧性坏死，继而引发神经功能缺损。复元醒脑汤（FYXN）是上海中医药大学附属龙华医院传统用于防治脑梗死的方剂，但其对大脑的靶向干预机制尚未完全阐明。

目的

本研究旨在探讨FYXN对缺血性脑卒中的治疗作用及其潜在机制，重点分析其对JAK2-STAT3信号通路的调控作用及对脑微血管内皮细胞活性的影响。

方法

本研究采用代谢组学、网络药理学、转录组学和蛋白质组学技术，探索FYXN治疗缺血性脑梗死的有效成分、潜在靶点和通路。通过16S rRNA测序分析缺血性脑梗死大鼠肠道菌群，并定量短链脂肪酸水平。采用TTC、H&E、尼氏（Nissl）和卢克索固蓝（髓鞘染色）染色评估脑组织病理变化。通过蛋白质印迹法和免疫组化验证脑梗死后JAK2-STAT3通路蛋白表达。采用CCK8法验证FYXN对大鼠和人脑微血管内皮细胞增殖活性的影响。

结果

FYXN中黄酮类化合物含量最高（24.09%），其次为萜类（12.8%）、苯丙素类（12.5%）和氨基酸类（11.28%）。网络药理学分析显示FYXN与脑梗死存在131个共同作用靶点。动物实验表明，FYXN显著减小MCAO模型大鼠梗死面积（p < 0.05），改善Zea Longa评分（p < 0.05），增强肢体抓握力。病理染色显示其改善神经元损伤，并显著增加尼氏体密度（P < 0.05）。与假手术组相比，MCAO组肠道菌群丰富度和多样性指数显著降低（p < 0.05，Cohen's d > 0.8）。丁酸盐水平与神经元损伤呈显著负相关（R = -0.6，p = 0.041），且丁酸盐可降低Zea Longa神经功能评分（p < 0.05，Cohen's d > 0.8），提高大鼠肢体抓握力（p < 0.01），未观察到明显脱髓鞘现象，此趋势与尼莫地平一致。转录组学、蛋白质组学和蛋白质-蛋白质相互作用网络分析预测FYXN具有JAK2、STAT3、EGFR等治疗脑梗死的关键靶点。大鼠脑组织蛋白检测显示，与MCAO组相比，FYXN低、高剂量组均显著上调JAK2（倍数变化>2）、p-STAT3（倍数变化>2）和VEGF（倍数变化>2）表达，同时降低caspase-3表达水平。体外CCK8实验证实FYXN显著促进大鼠和人脑微血管内皮细胞增殖（p < 0.01）。

结论

FYXN治疗可能通过调节肠道脂肪酸代谢和潜在激活JAK2-STAT3通路，改善实验性脑卒中模型的脑梗死面积和神经功能缺损，为后续临床研究提供理论科学依据。

图文摘要

【前言】

缺血性脑梗死是一种由血栓阻塞脑血管引起的疾病，导致脑组织缺血缺氧，继而诱发神经元损伤和功能障碍。目前，缺血性脑卒中的治疗主要侧重于恢复缺血半暗带的血流。溶栓和取栓治疗已被证明可通过重建缺血区域血流来改善患者预后。然而，根据Marko等人 (2020) 的研究，在队列人群中溶栓治疗的频率有限，预计到2025年仅增长24%。有限的治疗时间窗意味着缺血性脑卒中的发病率和致残率仍然很高，给临床医生、社会及家庭带来了沉重负担。因此，寻找预防和治疗缺血性脑卒中的有效药物是一个具有重要意义且至关重要的医学研究课题。

血管生成和血流增加已被证明是促进缺血性脑卒中恢复过程的有利条件。脑血管细胞的增殖和侧支循环的重建在一定程度上决定了神经元的再生与凋亡 。血管生成过程受多种因素复杂相互作用的调控，包括各种生长因子（如IL-6、IL-10、胰岛素样生长因子和VEGF）以及昼夜节律 。鉴于这种复杂性，我们如何才能找到能够调控血管细胞增殖的有效物质？近年来，中医药（TCM）在缺血性脑卒中治疗领域引起了广泛关注。无论是中药复方 还是单味药成分均被证明可以促进血管生成并改善缺血性脑卒中的结局。研究表明，JAK2-STAT3通路在脑微血管内皮细胞中能有效治疗脑缺血性疾病。

新出现的证据表明，调控肠道菌群及其代谢物可在缺血性脑卒中的治疗中发挥作用 。因此，探索与肠道菌群相关的新靶点和新策略以提高缺血性脑卒中的疗效和患者预后至关重要。肠道菌群通过肠-脑轴与中枢神经系统进行双向通信 。短链脂肪酸（SCFAs）是肠道细菌发酵膳食纤维产生的主要代谢产物，可能作为以微生物群为靶点的干预措施的潜在介质，用以调节大脑情绪和认知功能。然而，鉴于肠道菌群的复杂性和动态性，需要进一步研究以阐明靶向肠道菌群及其代谢物治疗缺血性脑卒中的益处。

根据中医理论，在正气（气）虚弱的基础上，体内病理产物（痰和瘀血）积聚，导致痰瘀互结。气虚导致推动血液运行的动力不足，最终表现为中风。在复元醒脑汤（FYXN Decoction）方中，人参（Panax ginseng C.A.Mey）可大补元气。天南星（Arisaema erubescens (Wall) Schott）、石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）、水蛭（Whitmania pigra Whitman）、三七（Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen）、益母草（Leonurus japonicus Houtt）善于祛瘀化痰、活血通窍。制大黄（Rheum palmatum L）具有强大的抗炎活性并能恢复肠道稳态，从而通过菌群-肠-脑轴对缺血性脑卒中发挥治疗作用 。这些草药配伍使用可以补益五脏之气，祛除瘀血，确保气血畅通，从而防治中风。在我们先前的研究中，我们报道了FYXN传统上用于“祛瘀生新” ，并探讨了FYXN改善缺血性脑卒中的治疗机制。我们前期的研究表明FYXN可以促进VEGF水平；然而，对于JAK2-STAT3通路仍需更多证据。但我们研究的新颖之处在于，我们能否从多角度进一步阐明药物、靶点与通路之间的相互作用。例如，通过整合转录组学、蛋白质组学和代谢组学等多组学数据，我们旨在阐明FYXN的潜在作用机制，识别潜在靶点和生物标志物，并为治疗干预提供精确证据。这将为未来的临床研究奠定理论基础。

在本研究中，我们假设FYXN通过调节肠道菌群衍生的SCFAs和激活JAK2-STAT3通路来改善脑梗死（CI）。为验证这一假设，我们首先采用UPLC-MS/MS技术鉴定了FYXN的成分及含药血清的代谢成分。采用网络药理学将药物成分的作用靶点与疾病作用靶点相结合，从而预测关键分子靶点。在体内部分，通过线栓法阻塞大鼠大脑中动脉制作脑梗死模型。结合RNA-seq转录组学和DIA蛋白质组学，预测FYXN治疗后脑组织中的关键通路靶点。评估脑缺血大鼠的神经功能评分和肢体抓握力丧失情况。对脑组织切片进行TTC和H&E染色，观察大鼠M1皮层和海马CA1区的神经元。采用尼氏（Nissl）染色观察尼氏体，并对胼胝体进行髓鞘染色以评估脑梗死模型的病理变化。采用蛋白质印迹法（Western blotting）和免疫组织化学法检测通路中关键蛋白的表达。检测了大鼠肠道菌群群落及其代谢物，并利用16S rRNA测序和GC-MS技术研究了丁酸钠对MCAO模型大鼠的功能改善作用。在体外部分，我们使用FYXN研究其对人和大鼠脑微血管内皮细胞的影响，阐明其对该细胞增殖的作用。

【结果部分】

1.FYXN的体外物质基础与体内代谢成分。

图1. FYXN的体外物质基础与体内代谢成分。（A-B）FYXN在正离子模式和负离子模式下的总离子流色谱图。（C）FYXN化合物成分鉴定结果。（D）佛手柑内酯（Bergapten）。（E）三甲基甘氨酸（Trimethylglycine）。（F）α-亚麻酸（α-linolenic acid）。（G）Mesifurane。（H）2-己烯醛（2-hexenal）。（I-J）FYXN含药代谢血清在正离子模式和负离子模式下的总离子流色谱图。（K）FYXN含药代谢血清化合物成分鉴定结果。

2.FYXN在CI治疗中的潜在组成部分和靶点。

图2. 网络药理学分析法用于研究FYXN在治疗CI中的作用。（A）在Genecards、OMIM、PharmGKB和DisGeNet数据库中CI的目标基因。（B）CI和FYXN目标基因的交集。（C）草药-成分-靶点网络。（D）蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。（E）FYXN治疗CI的枢纽基因。（F）对20个枢纽基因的KEGG分析。

3.FYXN对MCAO大鼠具有保护作用，并促进大鼠和人脑微血管内皮细胞的增殖。

图3. FYXN能有效减少MCAO大鼠的梗死和神经功能缺损。（A）MCAO模型。（B）动物实验。（C）脑梗死24小时后的TTC染色。（D）脑梗死面积的定量分析（n=3）。（E）Zea Longa神经功能评分（n=4）。（F）MCAO建模前和24小时后大鼠握力测量的差异（n=6）。（G、J）每孔2500、5000、10000和20000个细胞时RBMECs/HBMECs的增殖能力（n=6）；（H、K）不同时间点的RBMECs（n=6）/HBMECs（n=5）；（I、L）OGD/R后的RBMECs/HBMECs（n=5）。与MCAO组相比，*P<0.05，**P<0.01；与假手术组相比，#<0.01。

4.FYXN对MCAO大鼠脑组织病理学的影响。

图4. FYXN可缓解MCAO大鼠的病理状况。（A）大鼠皮层（M1区域）的代表性苏木精-伊红（HE）染色显微照片（比例尺=50微米）。（B）大鼠海马（CA1区域）的HE染色（比例尺=50微米）。黑箭头指向受损的神经元细胞。（C）大鼠皮层的尼氏（Nissl）染色（比例尺=100微米）。（D）大鼠海马的尼氏染色（比例尺=50微米）。（E）皮层中神经元数量的定量分析（n=3）。（F）海马中神经元的数量（n=3）。

5.FYXN调节了MCAO大鼠中mRNA的表达。

图5. 通过RNA测序分析MCAO大鼠中的差异表达基因（DEGs）和信号通路。（A）各组的基因密度图（log2Counts）和样本相关性分析。（B）MCAO与假手术组以及FYXN与MCAO组的差异表达基因（DEGs）的火山图（P-adjust<0.05，Fold change=2）。（C）两组中差异表达基因的分布（在维恩图中，P-adjust<0.05）和逆转的差异表达基因（在柱状图中，P-adjust<0.05）。（D）MCAO大鼠中与JAK-STAT信号通路相关的基因的热图。（E）JAK-STAT信号通路被分为三个框：左侧（假手术），中间（MCAO），右侧（FYXN）。颜色的深浅随基因表达量的增加而加深。

6.FYXN调节了MCAO大鼠中蛋白质的表达。

图6. MCAO大鼠中差异表达蛋白（DEPs）和显著通路的蛋白质组学实验结果。（A）假手术组、MCAO组和FYXN组的PLS-DA图。（B）MCAO与假手术组以及FYXN与MCAO组的差异表达蛋白（DEPs）的火山图（P<0.05，Fold change=1.5）。（C）两组中差异表达蛋白的分布（在维恩图中，P<0.05）和逆转的差异表达蛋白（在柱状图中，P<0.01）。（D）MCAO大鼠中与JAK-STAT信号通路相关的蛋白的热图。（E）JAK-STAT信号通路被分为三个框：左侧（假手术），中间（MCAO），右侧（FYXN）。颜色的加深表示蛋白表达量的增加。

7.JAK2-STAT3激活的Western blot分析。

图7. FYXN在脑梗死24小时后对Jak2、p-STAT3、STAT3、IL6、VEGF、NF-κB、Caspase-3和AMPK蛋白表达水平的影响。（A）Jak2/β-actin的相对蛋白水平；（B）p-STAT3/β-actin的相对蛋白水平；（C）STAT3/β-actin的相对蛋白水平；（D）IL6/β-actin的相对蛋白水平；（E）VEGF/β-actin的相对蛋白水平；（F）NF-κB/β-actin的相对蛋白水平；（G）Caspase-3/β-actin的相对蛋白水平；（H）AMPK/β-actin的相对蛋白水平。（均值±标准差；n=3；*P<0.05，**P<0.01）。（I）大鼠脑组织中STAT3和VEGF的典型免疫组化照片。

8.FYXN对MCAO大鼠肠道菌群组成的影响。

图8. FYXN诱导的大鼠肠道微生物群变化。（A–B）Chao1和ACE指数反映肠道菌群的丰富度（n=4）。（C–D）Shannon和Simpson指数反映肠道菌群的多样性（n=4）。（E）基于主坐标分析（PCoA）和（F）相似性分析（ANOSIM）评估β多样性。（G）线性判别分析效应大小（LEfSe）。（H）各组间显著丰度差异的生物标志物（LDA值>4）。柱状图的长度代表生物标志物物种的贡献。（I）在纲、种、属、门、目和科水平上的肠道菌群变化。

9.FYXN通过改善肠道菌群产生的短链脂肪酸（SCFA）和丁酸盐介导的神经功能恢复。

图9. FYXN干预后及丁酸盐介导的MCAO大鼠短链脂肪酸（SCFA）含量检测。（A）短链脂肪酸的热图。（B）PCA模型的得分图。（C）PLS-DA载荷图模型。（D）粪便中丁酸、丙酸、戊酸和异戊酸浓度的定量结果。（E）Zea Longa评分与短链脂肪酸含量的Spearman相关性分析。（F）丁酸对MCAO大鼠的动物实验设计。（G）大鼠神经功能评分的Zea Longa统计结果。（与MCAO组相比，*P<0.05；与假手术组相比，#<0.01，n=4）。（H）MCAO建模前和24小时后大鼠的握力测量（n=3）。（I）胼胝体的LFB染色切片的代表性图像（比例尺=100微米）。

【结论与讨论】

在这项研究中，揭示了FYXN通过调节JAK2-STAT3信号通路，促进VEGF表达和血管生成，从而改善MCAO大鼠的神经功能缺损。此外，FYXN还通过调节肠道菌群产生的短链脂肪酸（SCFA），特别是丁酸盐，间接促进神经功能恢复。然而，研究存在局限性：未通过基因敲除或药理抑制等方法直接验证FYXN对JAK2-STAT3通路的作用，且未评估FYXN对全身代谢（如肝肾功能）的潜在影响，这些影响可能间接调节观察到的结果。未来研究需进一步验证FYXN的作用机制，并深入探讨其对全身代谢的潜在影响。

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