CAR-T 细胞疗法的新革命：体内直接改造技术如何突破现有困境？

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摘要：CAR-T 细胞疗法作为治疗复发/难治性血液肿瘤的突破性手段，已在临床取得显著成效，但体外制备的复杂性、高昂成本和漫长流程严重限制了其广泛应用。本文系统梳理了 CAR-T 细胞疗法的发展现状，深入解析了体外制备工艺的瓶颈，重点介绍了体内直接改造 CAR-T 细胞的新兴技术 —— 包括纳米颗粒递送核酸和病毒载体递送系统的原理、优势及挑战。通过对比两种技术路径的临床前数据，探讨了体内改造技术在扩大治疗适应症（如实体瘤、自身免疫疾病、感染性疾病等）方面的潜力，并展望了该领域未来的发展方向，为读者呈现一场即将到来的细胞治疗技术革命。

一、CAR-T 细胞疗法：从实验室到临床的突破与困境1.1 改写血液肿瘤治疗格局的 “活药物”

当 2017 年全球首个 CAR-T 细胞疗法获批时，医学界沸腾了 —— 这种能让复发 / 难治性 B 细胞白血病患者获得长期缓解的 “活药物”，彻底改变了血液肿瘤的治疗范式。CAR（嵌合抗原受体）是一种人工设计的蛋白质，它将抗体的抗原识别能力（通常是单链可变片段 scFv）与 T 细胞的信号传导域（如 CD3ζ 和 CD28、4-1BB 等共刺激域）结合，能精准引导 T 细胞攻击癌细胞（图 1A）。

图 1：体外与体内 CAR-T 细胞制备流程对比

在血液肿瘤领域，CAR-T 细胞疗法已创造多项奇迹：靶向 CD19 的 CAR-T 细胞对复发/难治性侵袭性 B 细胞淋巴瘤的完全缓解率达 40%-54%，对 B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）的缓解率更是高达 71%-81%；靶向 BCMA（B 细胞成熟抗原）的 CAR-T 细胞在多发性骨髓瘤治疗中也取得了突破性进展。更令人振奋的是，长期随访数据显示，部分患者的缓解期可接近十年，这些曾被判定为 “不治之症” 的患者实现了临床治愈的可能。

目前，美国 FDA 已批准 6 款 CAR-T 产品，包括靶向 CD19 的axicabtagene ciloleucel、tisagenlecleucel 等，以及靶向 BCMA 的 idecabtagene vicleucel 等，它们共同构成了血液肿瘤治疗的 “王牌部队”。

1.2 体外制备工艺：难以逾越的 “规模化鸿沟”

尽管疗效显著，CAR-T 细胞疗法的普及却被体外制备工艺牢牢困住。现有获批产品均采用 “个体化定制” 模式，其流程之复杂堪称医疗领域的 “精细手工业”（图 1A）：

细胞采集：通过白细胞分离术从患者体内获取 T 细胞；

运输与激活：T 细胞被送往专业生产车间，在体外通过 CD3/CD28 抗体和细胞因子激活；

基因改造：利用 γ- 逆转录病毒或慢病毒载体将 CAR 基因导入 T 细胞；

扩增与质检：改造后的 T 细胞在体外大量扩增，需通过严格的质量和安全性检测；

回输患者：合格的 CAR-T 细胞被运回治疗中心，经静脉输注给患者。

这一过程耗时 2-7 周（即“静脉到静脉时间”），期间快速进展的患者可能需要桥接治疗维持生命。更棘手的是，患者个体差异（如既往治疗史）、病毒整合的随机性等因素，会导致 CAR-T 产品质量参差不齐，直接影响治疗效果。此外，治疗成本高得惊人：单款 CAR-T 产品的标价超过 50 万美元，加上前期检测、白细胞分离术、淋巴耗竭化疗等配套治疗，总费用可达 100 万-150 万美元，这一价格将绝大多数患者挡在门外。

1.3 异基因 CAR-T 的探索与局限

为突破个体化制备的瓶颈，科学家曾寄望于异基因 CAR-T 细胞—— 即从健康供体获取 T 细胞制备 “现成” 产品。理论上，异基因 CAR-T 可降低 variability、简化质检流程、缩短治疗周期，但它面临两大难题：

移植物抗宿主病（GVHD）：供体 T 细胞可能攻击患者正常组织；

宿主抗移植物反应：患者免疫系统可能清除外来的供体 T 细胞。

为解决这些问题，研究者尝试了基因编辑（如敲除 T 细胞受体 TCR 以避免 GVHD）、HLA 配型供体库建设、敲除 MHC 或 CD52 基因等策略，但临床效果仍有限，且异基因 CAR-T 仍需淋巴耗竭预处理，可能导致长期血细胞减少和感染风险。因此，异基因 CAR-T 并未真正实现 “通用化” 的初衷。

二、体内直接改造技术：CAR-T 疗法的 “简化革命”2.1 核心思路：从 “体外定制” 到 “体内生成”

面对体外制备的困境，体内直接改造 CAR-T 细胞的思路应运而生：通过直接向患者输注携带 CAR 基因的纳米颗粒或工程病毒载体，让 T 细胞在体内 “原地变身” 为 CAR-T 细胞（图 1B）。这一技术彻底跳过体外培养步骤，有望实现 “现成”（off-the-shelf）产品的规模化生产，其优势显而易见：

流程简化：无需细胞采集和体外培养，大幅缩短治疗时间；

成本降低：规模化生产可显著降低单位成本，提升疗法可及性；

安全性优化：避免体外扩增导致的 T 细胞耗竭，可能减少细胞因子释放综合征（CRS）等毒性；

适应症扩展：无需淋巴耗竭预处理，为自身免疫疾病、感染性疾病等非肿瘤领域开辟可能。

2.2 两大技术路径：纳米颗粒与病毒载体的 “巅峰对决”

目前，体内改造技术主要分为两大阵营：纳米颗粒递送核酸系统和工程病毒载体系统，它们各有优劣，共同推动着技术突破（表 1）。

2.2.1 纳米颗粒：非病毒递送的 “灵活战士”

纳米颗粒凭借良好的生物相容性和可设计性，成为体内递送 CAR 基因的热门选择，其中脂质纳米颗粒（LNP）和聚合物纳米颗粒表现突出：

图 2：体内 CAR-T 细胞改造平台结构与机制

结构设计：LNP 由可离子化阳离子脂质、辅助脂质（如磷脂、胆固醇）和 PEG 修饰脂质组成，能通过静电作用包裹 mRNA，保护其不被降解；聚合物纳米颗粒（如 PBAE）则通过 pH 依赖的内体逃逸机制释放核酸。

靶向策略：通过表面修饰抗 CD3、CD4、CD8 等抗体，纳米颗粒可精准识别 T 细胞，提高递送效率（图 2 左）。

表达特点：mRNA 递送的 CAR 呈瞬时表达（通常持续数天至数周），这既是安全优势（可避免长期毒性），也可能需要多次给药维持疗效。

临床前研究已验证其潜力：在小鼠模型中，靶向 CD3 的 PBAE 纳米颗粒携带 CD19 CAR mRNA，经静脉注射后可使约 10% 的 T 细胞表达 CAR，6 次 weekly 给药的疗效与传统体外 CAR-T 相当；CD5 靶向 LNP 递送 FAP CAR mRNA，能有效清除心脏损伤模型中的活化成纤维细胞，改善心脏功能。

2.2.2 病毒载体：长效表达的 “稳定之选”

慢病毒载体和腺相关病毒（AAV）是病毒递送系统的代表，它们凭借高效的基因导入能力占据一席之地：

慢病毒载体：通过假型化改造（如替换为尼帕病毒糖蛋白）和表面修饰 scFv，可特异性靶向 T 细胞（图 2 右）。其优势是能将 CAR 基因整合到 T 细胞基因组，实现长期表达，适合需要持久疗效的适应症。

AAV 载体：不整合到基因组，通过 episomal 形式持续表达 CAR，安全性更高，但表达时间较短（数周至数年）。

在人源化小鼠模型中，靶向 CD8 的尼帕病毒假型慢病毒仅需 2×10⁶ transduction units，就能使 10%-35% 的 CD8⁺T 细胞表达 CD19 CAR，并完全清除 B 细胞；另一款携带 CD19 CAR 和雷帕霉素激活的合成细胞因子受体的慢病毒，可在体内诱导 CAR-T 细胞扩增，实现近 50 天的肿瘤控制。

2.2.3 技术对比：安全性与有效性的平衡艺术

纳米颗粒和病毒载体各有侧重：纳米颗粒的瞬时表达适合需剂量调整的场景（如降低 CRS 风险），且无插入突变风险，但需解决多次给药的免疫原性问题；病毒载体的长效表达适合长期治疗，但需严格控制脱靶整合（如避免插入原癌基因）和预存抗体的影响（表 1）。

表 1：CAR 基因递送平台对比

三、突破与挑战：体内改造技术的 “成长烦恼”3.1 临床前突破：疗效媲美传统 CAR-T

多项研究证实，体内改造的 CAR-T 细胞在疗效上不逊于体外制备产品：

在 Eμ-ALL01 白血病模型中，单次注射 3×10⁹个靶向淋巴细胞的纳米颗粒，与环磷酰胺 + 5×10⁶个体外 CAR-T 细胞的抗肿瘤效果相当，且能维持约 100 天的肿瘤控制；

在 Raji 淋巴瘤模型中，CD3 靶向的 CD19 CAR mRNA 纳米颗粒经 6 次 weekly 给药，可实现与体外 CAR-T 同等的疗效；

慢病毒载体在体内诱导的 CAR-T 细胞，能有效清除循环 B 细胞，且在人源化小鼠中表现出与人类患者相似的 CRS 特征，为临床转化提供了可靠参考。

这些结果表明，体内改造技术有望达到传统 CAR-T 的治疗效果，且在某些方面更具优势（如避免体外扩增导致的 T 细胞耗竭）。

3.2 核心挑战：从实验室到临床的 “拦路虎”

尽管前景广阔，体内改造技术仍需跨越多个难关：

3.2.1 递送效率与特异性

脱靶递送是最大隐患：若 CAR 基因意外导入癌细胞，可能导致 “表位遮蔽”（CAR 与癌细胞表面抗原顺式结合，阻碍 T 细胞识别）；若导入调节性 T 细胞等抑制性免疫细胞，可能加剧免疫抑制微环境。因此，提高对 T 细胞的靶向性是关键，目前通过抗体修饰、载体工程等手段，靶向效率已显著提升（如纳米颗粒可使 75% 的转染细胞为 T 细胞），但仍需优化。

3.2.2 表达持久性与安全性

纳米颗粒的瞬时表达可能需要多次给药，而重复注射可能引发免疫原性（如机体对 CAR 或载体产生抗体）。研究显示，LNP-mRNA 在杜氏肌营养不良、精氨酸酶缺乏等疾病中可实现多次给药的累积效应，但 CAR-T 治疗的重复给药安全性仍需验证。

病毒载体的整合风险也不容忽视：早期 γ- 逆转录病毒治疗 X-SCID 时，因插入原癌基因 LMO2 附近导致患者发生 T 细胞淋巴瘤。虽然后续 “自灭活” 载体（SIN）降低了风险，但体内改造需警惕罕见的干细胞转导，可能引发远期恶性转化。

3.2.3 免疫微环境的 “暗礁”

体内生成的 CAR-T 细胞需面对复杂的肿瘤微环境（如实体瘤的纤维化屏障、免疫抑制因子），其活性可能受抑制。此外，CAR-T 细胞的过度激活可能引发 CRS 和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS），如何平衡疗效与毒性是临床转化的核心问题。

四、适应症拓展：从癌症到更广阔的医疗领域

体内改造技术的独特优势（如无需淋巴耗竭、可规模化生产），使其有望突破 CAR-T 仅用于血液肿瘤的局限，向更广泛的疾病领域进军。

4.1 实体瘤：攻克 “硬骨头” 的新希望

实体瘤一直是 CAR-T 治疗的难点，其原因包括抗原异质性、微环境抑制等。体内改造技术可能通过以下方式突破：

多靶点联合：利用纳米颗粒或病毒载体的组合，实现对多个肿瘤抗原的同时靶向，降低逃逸风险；

组织穿透性提升：局部给药（如瘤内注射）可提高 CAR-T 细胞在实体瘤中的富集；

微环境调节：共递送 CAR 基因与免疫检查点抑制剂（如 PD-1 siRNA），解除微环境抑制。

临床前研究显示，靶向成纤维细胞活化蛋白（FAP）的体内 CAR-T 细胞可减少心脏纤维化，提示其在实体瘤微环境改造中的潜力。

4.2 自身免疫疾病：精准清除 “叛逆” 细胞

自身免疫疾病（如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮）的核心是免疫系统攻击自身组织，其中 B 细胞异常活化是重要诱因。体内 CAR-T 技术可精准清除自身反应性 B 细胞，且无需淋巴耗竭，安全性更高：

在系统性红斑狼疮模型中，CD19 CAR-T 细胞可清除致病 B 细胞，且体内改造避免了体外制备导致的 T 细胞功能受损；

与单克隆抗体相比，CAR-T 细胞能穿透组织，清除组织驻留的异常 B 细胞，更彻底地控制疾病。

目前，CD19 CAR-T 治疗系统性红斑狼疮的临床试验已启动，初步结果显示出良好的安全性和疗效。

4.3 感染性疾病：对抗病毒的 “智能部队”

在 HIV、乙肝等慢性感染中，病毒可潜伏在细胞内逃避免疫清除。体内 CAR-T 技术可靶向病毒抗原（如 HIV 的 gp120），精准清除感染细胞：

HIV 感染者超过 3800 万，体外 CAR-T 的个体化制备难以覆盖，而纳米颗粒 - mRNA 系统（参考新冠疫苗的规模化经验）可实现普及；

无需淋巴耗竭，避免削弱患者抗病毒免疫，更适合感染性疾病治疗。

全球首例 HIV 靶向 CAR-T 治疗已完成，为这一领域开辟了新路径。

五、未来展望：技术融合与学科协作的 “大时代”

体内直接改造 CAR-T 细胞技术正处于从实验室走向临床的关键阶段，未来需在以下方向突破：

递送系统优化：开发更高效、低免疫原性的载体（如自扩增 RNA、环形 RNA 延长表达；改造病毒衣壳降低预存抗体影响）；

精准调控表达：通过 UTR 工程、诱导型启动子等，实现 CAR 表达的时空控制，平衡疗效与毒性；

适应症优先级：优先探索无现有 CAR-T 产品的领域（如自身免疫疾病、感染性疾病），或需多次给药的场景（如纤维化）；

临床转化策略：利用免疫健全小鼠、人源化小鼠和非人灵长类模型，系统评估安全性和剂量效应关系。

这一技术的成熟离不开多学科协作：化学家优化载体结构，免疫学家解析微环境机制，临床医生设计试验方案， 监管科学家制定标准 —— 只有各方合力，才能让体内改造 CAR-T 细胞技术真正成为普惠的 “活药物”。

正如 CAR-T 细胞疗法改写了血液肿瘤的治疗史，体内直接改造技术或许将再次颠覆我们对细胞治疗的认知。在这场医学革命中，“复杂” 正让位于 “简便”，“昂贵” 正让位于 “普惠”，而患者将最终成为最大的受益者。

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