CAR-T细胞疗法的革命：体内生成技术

自体嵌合抗原受体（CAR）T 细胞疗法已彻底改变难治/复发性 B 细胞癌症的治疗，但存在制造复杂、成本高、对实体瘤疗效有限等问题；为此，体内（in vivo）CAR T疗法应运而生。

背景介绍

癌症治疗现状：癌症仍是全球重大健康挑战，传统治疗（手术、放疗、化疗）对晚期或耐药癌症效果有限，免疫疗法（如 CAR T、检查点抑制剂）成为新方向。

CAR T 疗法定义：通过基因工程改造 T 细胞，使其表达嵌合抗原受体（CAR），精准识别并清除癌细胞，分为体外（ex vivo） 和体内（in vivo） 两种策略。

CAR结构与基因编辑工具

1、CAR 结构设计至关重要：核心结构含 4 个功能区域，各区域作用明确，详见之前的文章介绍和

Fig. 1: Overview of CAR structure.

2、基因编辑工具：用于在T细胞中稳定表达 CAR的基因编辑工具，主要特点如下表所示：

体外细胞ex vivo疗法

1. 制备流程

（1）采集患者或供体血液；（2）提取 T 细胞；（3）基因改造（导入 CAR 构建体）；（4）体外扩增 CAR T 细胞；（5）回输患者体内攻击癌细胞（图 2）。

Fig. 2: Process of ex vivo CAR T therapies.

2.分类：

o自体CAR T：使用患者自身T细胞，靶向性强，避免排斥，但制造依赖患者 T 细胞质量；

o异体CAR T：使用健康供体T细胞，可 “现成可用”，但需解决移植物抗宿主病（GVHD）与T细胞自相残杀问题（如用 CRISPR删除CD7、TCRβ链）。

3.临床成效与局限

（1）临床成效：多款产品获 FDA 批准，主要用于血液癌，部分实体瘤进入临床试验（表 1）：

（2）主要局限：

o 制造与成本：流程复杂（耗时数周）、依赖专业生产设施，成本高，患者可及性低；

o 副作用：易引发细胞因子释放综合征（CRS）、神经毒性，需严格临床监测；

o 疗效局限：癌细胞易产生耐药性导致复发，对实体瘤疗效有限（受肿瘤微环境抑制）；

o 异体风险：异体 CAR T 存在 GVHD 与免疫排斥风险。

体内细胞in vivo疗法

1.核心优势与机制

(1)核心优势：无需体外操作，通过载体（病毒或纳米载体）直接在患者体内递送 CAR 基因，生成 CAR T 细胞，可降低成本、缩短治疗周期、提升患者便利性。

(2)机制：将 CAR 构建体与基因编辑工具封装于载体，系统给药后，载体靶向 T 细胞并释放 cargo，诱导 T 细胞表达 CAR，进而清除癌细胞（图 3）。

Fig.3:thein vivo CAR T therapy for cancer treatment.

2.递送系统研究

(1)病毒载体：

o 常用类型：慢病毒、逆转录病毒、腺相关病毒（AAV），需通过融合 T 细胞靶向配体（如抗CD3 scFv）提升靶向性；

o 研究案例：Pfeiffer等用靶向CD8+ T细胞的慢病毒递送 CD19-CAR，在人源化小鼠中成功清除 CD19 + 细胞；Agarwalla 等开发含逆转录病毒颗粒的植入式支架，1 天内完成体内 CAR T 制造。

(2) 纳米载体：

o 常用类型：聚合物（如聚 β- 氨基酯）、脂质（如脂质纳米颗粒 LNP）、外泌体，优势为低毒性、低免疫原性、可规模化生产；

o 研究案例：Zhou等开发CD3靶向LNP，负载CD19-CAR与IL-6 shRNA，在白血病小鼠中实现CAR T持续表达（达41 天），并降低CRS风险；Smith等用聚合物纳米载体在淋巴瘤、肝癌模型中实现T细胞原位重编程。

Fig. 4: Delivery vehicles for in vivo CAR T generation.

3. 工业与临床进展

(1) 工业进展：多家企业推进研发，如EXUMA Biotech的慢病毒载体靶向 CD3+ T细胞，其CCT303-406用于HER2阳性实体瘤，进入临床 I 期；Umoja Biopharma的VivoVec™平台，在非人灵长类中实现CAR T高效生成，且无毒性；

(2) 临床前进展：多项研究在小鼠模型中成功，如 AAV介导的CD4 CAR可使 T 细胞白血病消退（4/6小鼠完全缓解），CD3靶向聚合物纳米载体可延长白血病小鼠生存期（120天随访中延长5天）。

4.关键挑战

(1) 靶向与转染效率：病毒载体靶向性有限，易转染非 T 细胞；纳米载体转染效率低，尤其质粒 DNA 需进入细胞核，易被溶酶体降解；

(2) CAR T细胞持续性：体内生成的 CAR T 细胞存活与功能维持时间短，需通过优化 CAR 共刺激域（如 4-1BB）、抑制 T 细胞耗竭提升持续性；

(3) 实体瘤难题：实体瘤微环境 immunosuppressive，抑制CAR T活性；抗原异质性导致CAR T无法全面识别癌细胞，易复发；

载体安全性：病毒载体可能引发免疫反应与插入突变；纳米载体生物降解性差，可能积累毒性。

监管要求及临床转化难点

1.监管要求

（1）载体标准：FDA/EMA要求病毒载体需检测纯度、稳定性与安全性（避免插入致癌），脂质纳米载体需评估细胞毒性与基因毒性；

（2）基因编辑工具：需验证CRISPR/Cas9等工具的脱靶效应，推荐使用高保真Cas9变体降低风险；

（3）临床数据：需提供充足的安全性（如神经毒性、CRS 发生率）与有效性数据，包括长期随访（监测延迟不良反应）。

2.临床转化难题

（1）患者入组：需制定精准的eligibility标准，筛选最可能获益且风险低的患者；

（2）试验设计：需确定合理剂量，平衡疗效与毒性，同时评估不同癌症类型的适用性；

（3）审批路径：需通过BLA（FDA）或MAA（EMA），流程复杂，耗时久。

未来方向

1. 载体优化：设计双靶向载体（如双特异性 DARPins-AAV）提升 T 细胞靶向性，开发pH响应型纳米载体促进溶酶体逃逸；

2. CAR 设计：构建多抗原靶向 CAR（如同时识别 CD19 与 CD22），增强抗实体瘤能力；

3. 模型改进：推广患者来源异种移植（PDX）、人源化小鼠模型，提升临床前研究与临床的相关性；

4. 工艺完善：优化纳米载体规模化生产工艺（如微流控技术），降低成本。

参考文献：Thuy Anh Bui, et al. Advancements and challenges in developing in vivo CAR T cell therapies for cancer treatment. eBioMedicine 2024;106: 105266. Doi:10. 1016/j.ebiom.2024. 105266

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