北京大学程和平等团队合作最新Nature子刊

2025年8月21日，北京大学程和平、王爱民和吴润龙共同通讯在Nature Methods在线发表题为“A versatile miniature two-photon microscope enabling multicolor deep-brain imaging”的研究论文。该研究介绍了 FHIRM-TPM 3.0，这是一款 2.6 g 的微型双光子显微镜，能够对自由活动的小鼠进行多色深部脑成像。

该系统集成了宽带抗谐振空芯光纤，具有传输损耗低、在 700 nm 至 1,060 nm 范围内色散最小以及激光功率耐受性高的特点。通过校正色差和球差并优化荧光收集孔径，作者实现了深度超过 820 μm 的皮质神经元成像，并使用 GRIN 透镜实现了单树突棘分辨率的海马 Ca2+成像。此外，作者设计了三个可互换的共焦物镜，允许将视场扩展十倍至 1 × 0.8 mm²，横向分辨率范围为 0.68 μm 至 1.46 μm。通过在激发波长为 780 nm、920 nm 和 1,030 nm 的条件下进行多色成像，作者研究了清醒 APP/PS1 转基因小鼠皮层中线粒体和细胞浆 Ca2+活性与淀粉样斑块沉积之间的关系。因此，FHIRM-TPM 3.0 提供了一个适用于各种脑成像场景的多功能成像系统。

微型显微镜的发展在揭示自然行为动物行为的神经基础方面发挥了重要作用。虽然单光子荧光显微镜一直是颇具价值的工具，但多光子成像具有独特的优势，例如固有的光学切片和深层组织穿透能力，使其适用于在突触、神经元和局部回路层面进行体积或多平面记录。在长期努力的基础上，微型双光子显微镜 (m2PM) 和微型三光子显微镜 (m3PM) 的出现，为此前在物理受限动物身上无法实现的实验范式研究提供了动力。例如，对自由行为动物的研究发现了一个与社会竞争相关的动态去抑制微电路、编码社会新奇感的稀疏 GABA 能神经集群、不受约束行为过程中神经元的空间调节以及睡眠-觉醒周期中小胶质细胞的动态监测。

尽管取得了这些进步，当前的 m2PM 技术仍然面临着一些未解决的挑战，特别是在多色荧光成像、实现更大的成像深度和获得更大、可扩展的视场 (FOV) 方面。在流行的 m2PM 和 m3PM 系统中，飞秒激光脉冲的传输依赖于光子带隙空芯光纤 (PBG-HCF)，每个光纤仅传输特定波长的光。因此，最近的报告中的双色成像利用单个激光器激发两种不同的指示剂，例如用于 GCaMP6 和 tdTomato 的 920 nm，尽管效率有所降低。在一项多色双光子内窥镜研究中，Guan 等人使用双包层光纤传输 830 nm 和 1,050 nm 波长，同时通过同步两个相干脉冲产生 927 nm 的第三个虚拟波长，从而能够同时对四种荧光团 (CFP、GFP、YFP 和 RFP) 进行成像。然而，该系统的 FOV 为 120 μm，帧率为 1.5 Hz，需要改进才能对大量神经元进行功能成像。

在最先进的台式系统中，双光子显微镜可以实现超过 800 μm 的皮层成像深度，而三光子显微镜可以达到高达 1.4 mm 的深度，用于神经元 Ca2+活动成像。最近开发的 m3PM 系统达到了 1.2 mm 的深度，能够对自由活动的小鼠进行海马 CA1 区 Ca2+成像。这一结果令人振奋，因为它表明微型多光子系统可以接近其台式同类系统的成像深度。由于先前报道的 m2PM 成像深度大多在 250 μm 左右（未使用 GRIN 透镜），因此有必要进一步开发 m2PM，以充分发挥其在自由活动动物深部脑成像方面的潜力。

m2PM 的视场 (FOV) 一直在稳步增长，从 FHIRM-TPM 的 130 × 130 μm² 增加到 FHIRM-TPM (2.0) 的 420 × 420 μm²，最近甚至达到了 1 × 0.788 mm²。此外，与台式系统类似，光学可扩展的视场优势有助于平衡分辨率要求和所研究的神经元群组规模，使 m2PM 能够以不同的放大倍数研究同一区域。克服上述限制将大大增强 m2PM 技术的适用性。

作者开发了 FHIRM-TPM 3.0，这是一款多功能的 m2PM 系统，在先前开发的基础上融入了多项理想特性。通过设计和制作宽带反谐振空芯光纤 (AR-HCF)，并系统地优化整体光学设计，作者实现了三种激发波长（780 nm、920 nm 和 1030 nm）下的多色成像，并将皮层成像深度扩展至 820 μm 以上。此外，通过在三个可互换的不同放大倍数共焦物镜之间切换，作者的显微镜实现了十倍的视场变化，从而能够灵活地满足各种实验需求。

图1FHIRM-TPM 3.0的设计和测试（图源自Nature Methods）

参考消息：

https://www.nature.com/articles/s41592-025-02780-6