Nat Methods | 王思远团队开发多尺度染色质空间结构的调控因子筛选新方法

染色质的空间结构对多种关键的基因组功能具有重要影响，包括基因表达调控【1】和基因组复制【2】等。染色质空间结构的改变还与细胞的特化与分化、个体发育、衰老过程以及多种疾病（尤其是癌症）的发生密切相关【3】。尽管正确的染色质空间结构及其对细胞行为的影响至关重要，但目前对调控细胞核内染色质空间结构的分子机制仍知之甚少。这一局限主要源于研究工具的不足：缺乏能够在多尺度范围内高效筛选染色质空间结构调控因子的技术。

近期 ，耶鲁大学王思远研究团队 在Nature Methods上发表了文章Perturb-tracing enables high-content screening of multi-scale 3D genome regulators， 开发了一项名为 Perturb-tracing 的技术【4】。该技术创新性地整合了三种方法：（ 1 ）细胞条 编码 与原位解码技术 BARC-FISH ； （ 2 ）基于染色质追踪（chromatin tracing【5】）的三维基因组成像技术；（ 3 ）高通量 CRISPR 筛选 （screen） 。其中，BARC-FISH 则是团队在本研究中新开发的工具，通过滚环扩增（rolling circle amplification）扩增每条 gRNA 的条形码序列（barcode），并结合多轮成像实现高效解码，从而精确识别单细胞内的 gRNA 身份及其对应的基因扰动（genetic perturbation） 。 染色质追踪技术 则 是王思远在哈佛大学博士后期间开发的，其核心基于多重 DNA 原位荧光杂交（multiplexed DNA FISH），可在单细胞水平直接描绘单条染色体上多个基因组区域的空间位置，从而解析染色质的三维折叠结构。

研究人员 首先 构建了一个筛选文库（library），包含 420 条 gRNA，靶向 137 个基因及 10 个非靶向对照（non-targeting controls）。这 137 个基因既包括已知编码关键染色质空间结构调控蛋白的基因（如 NIPBL 和 CTCF【6】），也涵盖了 众多 可能参与染色质空间结构调控的潜在基因。利用 BARC-FISH 技术，研究人员在细胞文库中通过成像高效 地 解析 了 单个细胞内的 gRNA 身份。在染色质追踪实验中，他们以 22 号染色体（chr22）为模型，通过定位其 27 个拓扑相关结构域（topologically associated domains, TAD）的中心区域，在 TAD 至整条染色体的尺度上绘制了构象图谱。最终共分析了来自 17,304 个细胞的 57,286 条染色质构象，涵盖 1,407,797 个 TAD 的三维空间位置。

研究人员进一步系统分析了不同基因扰动对多层级染色质三维折叠结构的影响：（1）拓扑相关结构域（TAD）尺度下相邻 TAD 之间的空间距离变化；（2）A-B 隔室（A-B compartmentalization）尺度下 A-A、A-B 与 B-B 隔室间接触频率的变化；（3）染色体尺度下所有 TAD 之间的全局距离变化；（4）细胞核尺度下核形态特征，包括圆度 （ nuclear sphericity ） 和均一度 （ nuclear intensity unevenness ） 的变化。通过对 137 个候选基因的系统筛选，研究人员鉴定出 21 个在染色质及细胞核组织调控中具有关键作用的候选因子，并对其中 3 个进行了进一步验证。此外，该筛选具有高通量和高信息量的特点，使研究人员能够开展相关性分析，比较不同调控因子的三维基因组效应及多层级折叠结构之间的内在联系。例如，研究发现染色质整体压缩水平（chromatin compaction）与细胞核圆度之间存在显著相关性。

本研究建立的 Perturb-tracing 方法为三维基因组学提供了新的研究范式。该方法在单细胞水平实现了大规模扰动与多目标成像，显著提升了研究效率与信息量。该平台不仅能够在多尺度上系统发现并表征新的染色质调控因子，还为构建三维基因组在不同生物学背景下的调控全景图谱提供了有力支持。

耶鲁大学王思远教授为本文的通讯作者，耶鲁大学博士生程育宝，胡梦玮，杨冰与Tyler Jensen为本文的共同第一作者。

https://www.nature.com/articles/s41592-025-02652-z

制版人： 十一

参考文献

1. Sexton, T. and G. Cavalli, The role of chromosome domains in shaping the functional genome.Cell, 2015. 160(6): p. 1049-59.

2. Pope, B.D., et al., Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.Nature, 2014. 515(7527): p. 402-5.

3. Zheng, H. and W. Xie, The role of 3D genome organization in development and cell differentiation.Nat Rev Mol Cell Biol, 2019. 20(9): p. 535-550.

4. Cheng, Y., et al., Perturb-tracing enables high-content screening of multi-scale 3D genome regulators.Nat Methods, 2025. 22(5): p. 950-961.

5. Wang, S., et al., Spatial organization of chromatin domains and compartments in single chromosomes.Science, 2016. 353(6299): p. 598-602.

6. Beagan, J.A. and J.E. Phillips-Cremins, On the existence and functionality of topologically associating domains.Nat Genet,2020. 52(1): p. 8-16.

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