工程化细菌实现溶瘤病毒递送与可控

近日，美国纽约州哥伦比亚大学生物医学工程系的Tal Danino教授团队通过设计一个名为CAPPSID（原核生物与小核糖核酸病毒协同作用实现安全细胞内递送）的平台来解决这些局限性。该系统由一种合成的细菌-病毒伙伴关系组成，通过全身递送将一种溶瘤性小核糖核酸病毒递送至肿瘤内，其中细菌可以保护病毒免受循环中抗病毒抗体的攻击。然后，一旦进入肿瘤内部，细菌便可以启动病毒并扩散。具体而言，CAPPSID依赖于一种工程改造的鼠伤寒沙门氏菌作为动态且合成的“衣壳”，在癌细胞内转录并递送病毒RNA，启动一种可直接裂解周围细胞的病毒。进一步对病毒进行工程改造，使其需要细菌提供的辅助酶才能完成病毒成熟和后续传播，从而将病毒复制限制在原始含细菌细胞之外的一个额外感染周期内。这种细菌-病毒协同作用共同实现了肿瘤抑制，并延长了工程病毒的复制时间。

该研究探索了设计两种具有临床相关性的微生物——鼠伤寒沙门氏菌和塞内加谷病毒（SVA）之间不同合作水平的合成策略。通过将细菌作为一种动态且可工程改造的“合成衣壳”，将复制子和全长病毒RNA递送至宿主细胞质中。利用CAPPSID技术，在完全免疫功能正常的小鼠中通过静脉注射，彻底清除了皮下小细胞肺癌（SCLC）肿瘤，并克服了系统性中和抗体的作用。此外，细菌将复制子递送至多种小鼠和人类细胞系中的实验表明，该技术能够突破病毒自然趋向性，递送非传播性自扩增病毒RNA。鉴于细菌可同时递送蛋白质和核酸，通过工程改造一种病毒，使其蛋白质成熟依赖于细菌提供的蛋白酶（通过替换合成切割位点实现），从而设计了微生物间的相互作用。总之，作者团队开发了一种多层工程方法，用于协调两种微生物系统以应用于溶瘤治疗。该平台还进一步展示了，与单纯递送复制子相比，当补充一种对病毒传播而言必需的工程化辅助酶时，通过微生物间的协调可显著提高病毒的持久性。虽然SVA对小鼠无毒性，但实现靶向复制和克服系统性中和作用仍是开发新型病毒疗法面临的核心挑战。通过这些努力，CAPPSID系统证明了病毒能够延长细菌的抗肿瘤效应。

细菌递送核酸（即细菌介导的基因转移，bactofection）此前已有应用，例如，利用根癌农杆菌在小麦中进行CRISPR/Cas9基因编辑，以及利用单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌递送小干扰RNA、含短开放阅读框的RNA和质粒。与之前通过工程化鼠伤寒沙门氏菌递送核酸的报道相比，利用鼠伤寒沙门氏菌中灵活可用的遗传工程工具，成功将大型病毒RNA递送至更广泛的细胞类型。基于先前细胞内递送的研究，病毒RNA的主动复制可在初始宿主细胞中引起细胞病变效应，同时还能扩散至未被细菌感染的周围细胞，从而扩大治疗范围。这种合作微生物联合体可能通过多种机制产生上述效果，包括直接细胞病变效应、通过微生物病原体相关分子模式和损伤相关分子模式激活先天免疫，以及在完整适应性免疫系统背景下的新抗原交叉呈递。

作者团队在病毒中插入正交切割位点的努力凸显了解决RNA病毒变异性的重要性。RNA依赖的RNA聚合酶以约万分之一的错误率掺入错误碱基。通过首先确定体内最常见的逃逸机制，并要求同时发生两种独立突变来降低这种逆转的可能性，从而将逃逸概率呈几何级数降低，以此减轻突变逃逸。然而，也可能发生其他类型的突变，如正交序列的整体缺失，尽管本研究中未观察到此类情况。插入额外的烟草蚀刻病毒（TEV）切割位点，甚至额外的蛋白酶/切割位点对，可进一步提高该系统的稳健性，并实现逻辑门控的病毒复制和传播。

图：工程细菌将自我复制的RNA递送到宿主细胞的细胞质中

转载自奇物论