博士毕业于福建农林大学，石河子大学农学院教授以通讯作者身份在国际权威期刊（IF=12.4）上发表研究论文

近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由石河子大学孙杰课题组及其合作团队撰写的“pseudo-GhFAD2-1 is a lncRNA involved in regulating cottonseed oleic and linoleic acid ratios and seed size in ‌Gossypium hirsutum”论文。该研究发现，源于棉花D亚基因组上GhFAD2-1的串联重复序列pseudo-GhFAD2-1（pGhFAD2-1）因剪接位点的改变使得pGhFAD2-1成为无蛋白质编码能力的lncRNA。进一步，对pGhFAD2-1进行过表达、基因编辑敲除、互作蛋白鉴定及染色体可及性分析等，揭示了pGhFAD2-1在调控棉籽脂肪酸组分合成、籽粒大小等方面的新功能。研究团队报道的这一棉花lncRNA，有助于深入认识异源多倍体的基因表达与调控，也为棉籽油的品质及种子大小的遗传改良提供了新的靶点和途径。

棉花（G. hirsutum）不仅是最重要的纤维作物，也是食用油的重要来源。在高等植物中，Δ12-脂肪酸脱氢酶（Δ12-fatty acid desaturase）催化单不饱和的油酸（C18:1）向多不饱和的亚油酸（C18:2）转化。陆地棉具有复杂的异源四倍体基因组（AADD; 2n=4x=52），GhFAD2-1（位于A基因组第13号染色体的GhFAD2-1A和D基因组第13号染色体的GhFAD2-1D）在棉籽发育过程中优势表达，是控制种子中C18:1向C18:2转变的关键基因，决定了棉籽中C18:2的含量。在D基因组还存在一个独特的，且与GhFAD2-1D紧密连锁，且高度同源的序列。将其命名为pseudo-GhFAD2-1（pGhFAD2-1）。序列分析发现，pGhFAD2-1是GhFAD2-1D的串联重复拷贝，且在重复事件发生过程中，一段 1, 221 bp 的序列插入到复制的 GhFAD2-1D 的编码序列中，导致其部分编码序列（227 bp）丢失。插入的部分序列（995 bp）、GhFAD2-1D的部分编码序列以及 GhFAD2-1D 的 5' 端和 3' 端部分序列共同形成了新的转录序列（1476 bp）。但剪接事件使得这个 1476 nt 的全长 cDNA 不再能够编码脂肪酸去饱和酶，仅具有一个 318 bp 的开放阅读框。全文主要研究结果如下：

1. pGhFAD2-1参与调控了脂肪酸成分的合成

通过遗传转化转化“YZ-1”，分别获得pGhFAD2-11过表达（OE）及敲除株系（KO）。与CK相比，KO株系中GhFAD2-1表达显著上调；而在OE株系中，其表达显著下调。在OE中，C18:1含量从20 DPA至60 DPA持续上升，成熟种子中达到21.36%，分别较CK和KO提高12.50%和29.38%。而OE的C18:2含量始终低于CK和KO。KO和CK成熟种子中C18:2的相对百分比分别为52.58%和50.86%，较OE的49.18%分别提高6.91%和3.41%。这表明OE中C18:1向C18:2的转化受到抑制，导致C18:1更多积累；而KO则呈现相反趋势，表明pGhFAD2-1可通过调控GhFAD2-1影响脂肪酸去饱和过程。此外，KO的棉籽含油量在19.35%-20.62%之间，比CK提高2.21%-8.81%。相反，OE的含油量在17.38%-18.65%之间，与CK相比降低了1.58%-8.28%。相应地，KO种仁的含油量为33.05%-34.78%，比CK提高2.16%-7.51%（图1）。

图1 转基因植物与对照植物的鉴定与表型分析

2. pGhFAD2-1参与调控了棉籽大小

通过对成熟棉籽表型的比较发现，KO种子的长度和宽度分别为8.44 mm和3.97 mm，较CK种子（9.06 mm和4.23 mm）分别降低6.84%和6.15%，较OE种子（9.21 mm 和 4.40 mm）分别降低 8.36%和9.77%；KO种子的百粒重为8.53 g，较CK（9.35 g）和OE（9.99 g）分别降低8.77%和14.61%。这表明调控pGhFAD2-1的表达也会影响棉籽大小，进而改变棉籽的百粒重（图2）。

图2 调控pGhFAD2-1的表达对棉籽大小的影响

3. pGhFAD2-1不具备蛋白质编码能力

将pGhFAD2-1和GhFAD2-1的全长转录本以及预测的pGhFAD2-1 ORF分别克隆到含有人工突变起始密码子的GFP表达载体中。GFP荧光成像显示，在表达pGhFAD2-1-GFP 或pGhFAD2-1 ORF-GFP构建体的细胞中，未检测到荧光信号，这与蛋白质印迹结果一致。此外，酵母细胞异源表达后的SDS-PAGE分析显示，含有pGhFAD2-1全长转录本或其预测 ORF的构建体均未检测到蛋白质表达。相比之下，GhFAD2-1 阳性对照出现了预期条带。这些结果表明pGhFAD2-1缺乏蛋白质编码能力，其可能作为长链非编码 RNA（lncRNA）发挥作用（图3）。

图3 pGhFAD2-1编码蛋白能力分析

4. pGhFAD2-1互作蛋白的鉴定

基于RNA-pull down分析，鉴定并筛选出了pGhFAD2-1的潜在互作蛋白。进一步的质谱鉴定和生物信息学分析显示，在所有差异丰度蛋白质中，与染色体表观遗传修饰相关的组蛋白去乙酰化酶 1（HDT1）差异最显著。此外，在实验组中特异性鉴定出40S核糖体蛋白S12（RPS12），而在对照组中未检测到。为了证实 HDT1 或 RPS12 与 pGhFAD2-1之间的相互作用，使用针对 HDT1或RPS12 的特异性抗体进行了RNA免疫沉淀（RIP）实验。进一步的qRT-PCR分析显示，pGhFAD2-1在HDT1或RPS12 特异性免疫沉淀物中显著富集，表明存在特异性结合（图4）。Western Blot及ELISA酶活检测实验发现，当敲除pGhFAD2-1后，GhFAD2-1的蛋白表达水平及酶活水平均显著升高，而GhHDT1蛋白及基因表达水平则下降。EMSA及单杂实验结果表明，GhHDT1与pGhFAD2-1的203 bp的转录区，以及GhFAD2-1的启动子部分区域（同源于pGhFAD2-1的203 bp的序列）发生互作。上述结果表明，pGhFAD2-1通过招募染色质修饰蛋白GhHDT1至GhFAD2-1启动子区，从而调控GhFAD2-1的转录表达。微尺度热泳动技术（MST）实验表明，pGhFAD2-1可以与GhFAD2-1 mRNA竞争性结合核糖体蛋白GhRPS12，调控GhFAD2蛋白表达。

图4 pGhFAD2-1互作蛋白鉴定

5. pGhFAD2-1参与调控棉籽脂肪酸组分及种子大小的分子机制

通过靶向可及染色质高通量测序（ATAC-seq）结合RNA-seq分析等阐明了pGhFAD2-1参与调控棉籽脂肪酸组分及种子大小的分子机制：（1）pGhFAD2-1招募GhHDT1与GhFAD2-1的互作，在转录水平上抑制GhFAD2-1的表达，同时pGhFAD2-1通过与GhFAD2-1 mRNA竞争性结合RPS12，在翻译水平上抑制GhFAD2蛋白表达，进而影响棉籽发育过程中脂肪酸组分的合成。（2）pGhFAD2-1通过招募GhHDT1，调控ABA合成相关基因的附近区域的染色质可及性开放程度，从而抑制与ABA合成相关基因的表达，参与了调控棉籽的大小的发育（图5）。

图5 pGhFAD2-1参与调控棉籽 C18:2 含量和种子大小的分子机制

这项研究解析了pGhFAD2-1与组蛋白去乙酰化酶GhHDT1和40S核糖体蛋白GhRPS12相互作用，进而参与调控GhFAD2-1的表达水平，并影响了种子大小，为棉籽油品质和种子大小的遗传改良提供了新靶点和途径。此外，与人类和动物相比，植物lncRNA的研究尚处于起步阶段。与水稻和拟南芥不同，陆地棉的基因组是复杂的异源四倍体；解析lncRNA pGhFAD2-1的调控功能及网络，有助于深入认识异源多倍体作物的基因表达与调控。

石河子大学农学院刘峰教授、孙杰教授、澳大利亚联邦科学与工业组织(CSIRO)农业与食品研究所Qian-Hao Zhu研究员为该研究工作共同通讯作者，博士生陈海虹为论文第一作者。研究工作得到了国家重点研发项目、国家自然科学基金等项目的资助。

论文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70291