下一代多特异性抗体的构建模块

引言

自19世纪末现代药物发现以来，在一系列关键技术突破的促进下，药物发现的方法和药物模式方面都发生了重大变化。20世纪50年代建立的X射线晶体，开创了未来几十年基于结构的药物设计。20世纪70年代重组DNA和杂交瘤技术的发现使得第一种重组蛋白疗法成为可能，例如来自礼来/基因泰克的Humulin和来自Amgen的Epogen，以及第一个单克隆抗体药物，Orthoclone OKT3。这些技术启动了一种新的生物药形态，目前，单克隆抗体已成为治疗开发中最受欢迎的药物形式。

然而，单克隆抗体单一靶向的局限性和不断增长的未满足的临床需求，促使研究人员进一步研究具有多特异性的分子。多特异性抗体（MsAbs）能够识别位于相同或不同靶标上的两个或多个表位，这种多重识别能力扩展了常规单克隆抗体的功能，允许多种应用，例如募集免疫细胞破坏肿瘤细胞或交联不同的细胞表面蛋白。

MsAbs通常在其结合模块的大小，构型，价态，灵活性和接近角度以及它们的可开发性，分布和药代动力学属性方面有所不同。自然界现有的能够结合的蛋白质，如抗体和细胞因子，提供了有价值的结合模块，其序列和折叠经过数百万年的优化。相比之下，人造模块，如小蛋白和从头合成蛋白，通过使用Alphafold2和Rosettafold等工具预测蛋白质结构，也证明了人工合成转化药物发现的潜力。

一、Fab

设计MsAbs的一种简单而简约的方法是使用IgG的Fab部分。Fabs由HC的VH和CH1结构域以及整个LC（VL和CL）组成，形成了一个非常稳定的异二聚体，其中大约100个残基参与了多个稳定接触，包括氢键、盐桥、疏水相互作用和范德华力。

此外，与scFv形成鲜明对比的是，Fab表面亲水，易于暴露于溶剂，因为它从IgG中提取只需要在连接CH1和Ab铰链的柔性接头处进行截断。因此，稳定的蛋白质核心和巨大的亲水表面使Fabs成为组装MsAbs的流行选择，特别是对于高浓度和/或皮下给药（SC）配制的药物。然而，由两条不同的多肽链组成的模块需要异二聚体组装，这是含有两个或多个不同Fab的MsAbs的重要考虑因素，因为必须保证每个HC和LC的正确同源配对。由于异源IgG分子的单细胞表达可以产生多达10种不同的错配物种，因此人们开发了许多工程化策略来实施正确的链配对，比如电荷配对突变（CPM），knob-into-hole（KiH）和单链Fabs（scFabs）等）。另一种方法涉及使用通用LC。这些通用LC可以与两个或多个不同的HC配对。

目前，临床试验中的MsAbs有大约58%含有至少一个Fab作为构建模块。此外，首批获得美国食品和药物管理局（FDA）和欧洲药品管理局（EMA）批准的MsAbs之一，用于治疗血友病的emicizumab，其中包含两个共享一个共同LC的Fab。

二、ScFv

scFv是通过灵活接头连接重链（VH）和轻链（VL）可变区而产生的分子。最常见的接头是（Gly4Ser）3，连接序列也可以定制为更具刚性甚至带静电。此外，scFv分子中的VH-VL或VL-VH取向影响该模块的结合和可行性。scFv目前也是制备MsAbs非常有吸引力的模块，因为单个多肽链避免了链配对的复杂性，并且大约只有Fab大小的一半。此外，它们可以使用多种接头串联融合到Fc的N和C末端和/或进行两到四个拷贝的串联。

但是，由于该模块缺少Fab的恒定区域CH1和CL，因此也不存在CH1-CL界面C末端的天然二硫键。尽管蛋白质接头可以帮助克服scFv在纯化和储存过程中固有的不稳定性，但由于动态VH/VL界面，热稳定性平均低于亲本Fab。为了解决这个问题，可以增加二硫键来加强这个界面并提高热稳定性。但同时也会使许多Fab在转化为scFv时无法保留功能。目前，可以通过计算蛋白质设计来鉴定改善稳定性的定制二硫键。

另外，scFv缺乏CH1/CL区域，动态的VH/VL界面成为一个具有聚集倾向的关键区域。聚集通常与分子浓度相关，因此当达到像抗体一样的浓度时，含有scFv的MsAbs可能表现出较差的单分散性，因此限制了治疗产品的开发应用。但是，其简单平台技术的吸引力加上开发周期后期才会考虑的技术问题，导致许多含有scFv的MsAbs进入临床。目前，正在临床开发的MsAbs中约有36%含有至少一种scFv作为模块之一，其中blinatumomab是来自Amgen的两种scFv串联分子，于2014年获得FDA批准。

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三、纳米抗体（VHH）

除 IgG 外，骆驼和鲨鱼天然产生重链抗体，其中抗原结合区由重链（ VHH ）的单个可变结构域组成。此外， VHH 也可以在表达人源化 VHH 的转基因小鼠模型中产生，或者通过展示技术筛选。这些 VHH ，也称为纳米抗体或单域抗体（ SDAb ），在 MsAbs 的组装中具有巨大的优势：首先，它绕过了 Fabs 中同源 HC/LC 配对的需要，并避免了互连接头的使用，例如 scFv 。此外，由于其 12-15 kDa 的紧凑结构， VHH 显示出理想的可开发性属性，包括高产量，在高蛋白质浓度低聚集，低粘度和高热稳定性。

由于其绝佳的生物物理特性， VHH 可能适合吸入给药，因为它们的小尺寸确保了体循环中的半衰期短。此外， VHH 的结合亲和力可以高达皮摩尔级，即使没有 VL ，也与最佳 Fab 或 scFv 分子的结合亲和力相匹配。尽管最初对 VHHs 的非人源存在疑虑，但随着 2019 年 FDA 批准 caplacizumab ，这些问题迅速得到缓解。模，进入临床开发阶段开发的 MsAbs 约有 10% 含有 VHH 作为模块之一。

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四、抗体Fc

MsAbs 极大地受益于 Fc 在部署链配对技术时异二聚化的能力。 Fc 异二聚化的两种流行方法是使用 KiH 突变和 CPM 。 KiH 突变引入一个空间庞大的氨基酸，如一条链上的色氨酸或酪氨酸，另一条链上的小氨基酸如甘氨酸或丙氨酸，分别形成突起和口袋。虽然这种方法对于减少同型二聚体特别有效，但空穴同型二聚体仍然可以形成，并且必须通过额外的纯化步骤与所需的异二聚体分离。相反， CPM 在一条链上引入带正电荷的残基，在另一条链上引入带负电荷的残基，以促进异二聚体的形成。这使得 Fc 成为产生需要不对称形式分子的引擎，因为不同的模块可以连接到 Fc 的每一半的 N 和 C 端。此外，含有 Fc 的 MsAbs ，具有更高的表达产量和高溶解度，且易于通过蛋白 A 捕获纯化。最后， Fc 可以识别多种细胞表面上的几种受体，可以对其进行操作以改善功能。 毫不奇怪，目前在临床试验中大部分 MsAbs ，约 83% 都含有 Fc 。

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五、细胞因子

免疫系统拥有一系列复杂的细胞类型，这些细胞类型由一类分泌的细胞外信号蛋白（细胞因子）精心控制，通常小于30 kDa。迄今为止，已经鉴定出100多种不同的细胞因子，每种细胞因子都具有独特的免疫生态位，它们代表了一个现成的模块库，可以用于治疗。毫不奇怪，目前在临床试验中约有超过14%的MsAbs中携带细胞因子。然而，这些细胞因子通常表现出狭窄的治疗窗口，主要是由于高毒性特征。这表明，为了发挥这些细胞因子的全部潜力，必须改善毒性特征。

细胞因子的可开发性

当重组表达时，许多细胞因子表现出聚集倾向，这会影响CMC，和潜在的免疫原性。这可能是由于大多数细胞因子由螺旋束基序组成并显示多个结合界面，这通常为富含疏水性斑块，这可能导致聚集。另一个是游离半胱氨酸的情况。IL-1家族显示出多种游离半胱氨酸，使其易于通过非经典二硫键聚集和/或在暴露于氧化环境的情况下导致效力降低。因此，需要引入了新的C到S替代来缓解这些问题。例如，临床上大多数IL-2分子都含有C125S突变，这对于避免开发过程中的聚集至关重要。

调节细胞因子选择性

细胞因子受体在不同细胞类型上以不同水平表达，通过调节细胞因子受体亲和力提供了偏向细胞类型的机会。例如IL-2，减弱与亚基IL-2Rα的结合减少了免疫抑制性Treg细胞的活化，导致更高的T效应细胞活化。Neoleukin Therapeutics开创了一种新的策略，通过设计具有定制功能和增强可开发性的从头合成细胞因子，比如Neo-2/15，将从头合成的螺旋移植到天然IL-2骨架上，完全消除了与IL2Rα的结合，同时在这种螺旋束蛋白上建立了额外的稳定性。

调节细胞因子的靶向性

全身细胞因子信号传导的毒性促使这些细胞因子与其他靶向分子偶联，目的是降低外周细胞因子活性。这些与细胞因子融合的模块试图将细胞因子定位于肿瘤微环境，并通过识别选定的肿瘤相关抗原（TAA）来降低外周活性。例如，罗氏已经证明了与IL-2突变蛋白融合的TAA的几个成功例子，包括PD-1，肿瘤抗原癌胚抗原（CEA）和成纤维细胞活化蛋白-α。

但是，为了使靶向方法产生效果，它必须驱动绑定事件的顺序。因此，确保识别TAA的模块的结合亲和力显著高于细胞因子与其受体的亲和力是关键。这通常对细胞因子进行突变，以减弱结合亲和力。

细胞因子的条件性激活

条件性激活策略试图通过依赖于响应组织特异性线索（即蛋白酶切割，靶标重建，pH变化，小分子诱导的变构）的蛋白质生物传感器来降低系统活性。例如，通过将肽甚至靶向受体与细胞因子融合来“掩盖”促炎细胞因子活性。一旦这些分子到达靶组织，通常通过切割编码肿瘤特异性蛋白酶的接头来释放细胞因子的完全活性。一个案例是与异二聚体Fc融合的IL-2突变蛋白，该异二聚体Fc通过金属蛋白酶（MMP）可切割接头携带融合在Fc N末端的IL2和IL-2Rβ。

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六、微小蛋白

虽然基于抗体的疗法一直是主要的生物制剂，但其他类别的蛋白质也在探索中。从历史上看，使用非 Ig 或“替代”模块的动机通常是为了克服天然模块的局限性，如稳定性差、组织渗透性差、无法靶向细胞内蛋白质或药物输送途径（即静脉注射）等。除了为这些缺点提供解决方案外，非 Ig 模块作为治疗剂本身可能会提供不同的药代动力学和药效学特征，并可以获得天然模块无法获得的靶结合界面。

通常，这些替代支架是来源于具有所需特性的蛋白质的单结构域。来源的蛋白可能是人类、细菌、无脊椎动物，甚至是从头设计的，大小范围从4kDa到20kDa。

Monobodies, pronectins 和adnectins

与免疫球蛋白最相似的是Monobodies, pronectins 和adnectins，每个都包含一个纤连蛋白3型（TNF3）结构域，由七条柔性环连接的反平行β链组成。通常，这些柔性环中的三个是多样化的，用于以类似于抗体CDR的方式结合。这些特征使它们能够作为不同靶标的结合物，比如BMS-986089，一种adnectin-Fc融合，目前正处于脊髓性肌萎缩症的III期临床试验。

Anticalins

Anticalins基于脂质运载蛋白家族，参与亲脂性物质的细胞外运输。它们具有一个β折叠桶状结构，具有一个内腔和四个高度灵活的环。脂质运载蛋白与免疫球蛋白可变区的结构相似性使其可以对柔性环进行工程化设计，以靶向各种治疗靶点。一个利用Anticalins结合的例子是PRS-343，一种目前处于II期临床试验中的41BB/HER2双特异性靶向药物。

Affibodies

Affibodies是葡萄球菌蛋白A的衍生物，是少数细菌来源的模块之一。它是一个高度稳定的三α螺旋束结构，其螺旋表面经过重新设计，可以用于靶向。Affibodies的分子量约为6.5 kDa，是最小的模块之一。这种较小的尺寸可能使其能够靶向其他较大模块无法到达的表位。然而，作为一种细菌蛋白，免疫原性可能是个问题。

DARPin

DARPin是由两个反平行α螺旋单元组成的模块化蛋白，相邻单元由β发夹连接。每个模块单元由33个残基组成，完整的蛋白可以由多达29个连续的重复单元组成，最常见的长度是4到6个单元。这些蛋白与富含亮氨酸的重复蛋白有关，通常存在于脊椎动物先天免疫系统的Toll样受体中。与其他模块的结合界面相比，DARPin界面具有很高的刚性，形状最凹，这使得DARPin可能成为针对某些靶标的更合适的结合支架。由DARPin组成的MsAb的一个例子是MP0250，这是一种由四个DARPin组成的单链三特异性分子。目前，它正处于针对多种适应症的II期临床试验中。

Knottins

Knottins是长度通常为30至50个氨基酸的短肽，具有由三个二硫键形成的高度稳定的保守折叠。这组成了一个刚性支架，其中包含许多多样化的柔性环。由于其体积小，Knottins会迅速从体内清除。结蛋白是用于产生结合剂的最小模块，有可能靶向一些蛋白上原本无法接近的表位。然而，迄今为止，绝大多数Knottins因其半衰期短而被用作诊断剂，尚未用于MsAbs。

从头合成的微小蛋白

从头合成的蛋白质设计使用基于生物物理特性和预定蛋白质结构的大数据集的预测算法指导的计算工具来生成人造蛋白质折叠，甚至是具有自然界中没有的氨基酸序列的完整蛋白质。从头开始的微小蛋白是一类新的、快速发展的模块形式，有可能加速功能性MsAb的发现。然而，从头合成的小蛋白应该被视为一把双刃剑：一种具有更快时间线、优化可开发性、新功能或定制条件激活潜力的高度动态模块，但也是一种由几乎没有人类同源性的氨基酸序列组成的具有固有免疫原性风险的模块。Neo-2/15就是一种最具体内特征的新生微小蛋白，模拟人类IL-2。

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结语

多特异性抗体无疑是下一代生物药的重要方向，它们潜力巨大，但也面临着前所未有的复杂性和开发挑战。要真正迈向下一代，关键在于深刻理解我们使用的各种构建模块的特性，以及它们成功组装成复杂四级结构的内在规则。这意味着，我们在选择这些模块时，不仅要考虑它能做什么，还要考虑它本身的表达、稳定性、纯化难易度、与其他模块的兼容性等等。

同时，我们也要认识到，计算蛋白设计，特别是机器学习的革命性整合，正在为这个领域带来前所未有的机遇。通过将这些智能工具融入到工作流程中，我们有望实现更智能、更高效、更可预测的多特异性抗体开发，最终更快地将这些能解决未满足医疗需求的创新疗法带给患者。

参考资料：

1.Next generation of multispecific antibody engineering. Antib Ther. 2023 Dec 8;7(1):37–52

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