科学家研发首个固载化类核糖体分子反应器，可触达此前化合物禁区

“我们成功研发了世界上第一例固载化的类核糖体分子反应器（RMMR，Ribosome-Mimicking Molecular Reactor），并一举攻克了结构中含有多个密集 N-Me 氨基酸或 α,α-二取代氨基酸的高空间位阻多肽的高效固相合成和自动化机器合成技术。”南京大学教授姚祝军告诉 DeepTech。

图 | 姚祝军（来源：姚祝军）

可能是几十年来 SPPS 领域为数不多的重大突破之一

很多人都知道，生物学“中心法则”中 RNA 翻译到蛋白质这一过程发生在核糖体。翻译时，核糖体小亚基先与从细胞核中转录得到的信使 RNA 结合，读取 mRNA 信息再结合核糖体大亚基构成完整的核糖体，将转运 RNA 运送的氨基酸分子合成多肽。在本次研究中，该团队把核糖体视作一架巨大的多肽制造“分子机器”，经不断的思考、讨论和修正，逐步形成了一种“跳出传统 Merrifield SPPS 习惯思维”的新思路：即模拟核糖体的蛋白质翻译过程，使类似的“肽酰”和“氨酰 tRNA”单元相互靠近并发生分子内“ON”酰基转移而形成目标肽键，克服现有 SPPS 技术在反应原理上挣扎的效率困境。

RMMR 分子反应器包含两个关键部分：一个多肽合成把手区（模拟肽酰 tRNA）和数个酰基活化区（模拟氨酰 tRNA）。将其固定至商用树脂表面即成为可循环运作的反应平台。RMMR SPPS 通过 RMMR 反应平台进行氨基酸活化并快速与多肽链 N 端氨基发生“伪均相”酰基转移反应，从根源上解决了传统 SPPS 两相间酰基转移的低效率问题。这种由可循环工作的分子机器实施的目标肽键形成方案，就像换了一个赛道完全颠覆了传统 Merrifield SPPS 合成的工作原理和反应模式。同时，这种迭代 RMMR 方法也承接了传统 SPPS 在氨基酸活化酯方面的部分成就，赋予其操控反应的“开/关”控制：商用的 N-Fmoc 氨基酸与温和廉价缩合剂 DIC 所形成的活性中间体将 RMMR 树脂上的活化功能区“turn on”，随后根据空间邻近效应介导发生分子反应器“内/间”快速酰基转移，从而形成目标酰胺键；而那些前一流程未被反应掉的活化功能区则在随后哌啶处理支载多肽末端 N-Fmoc 保护基的同时也被“turn off”，准备好迎接下一轮氨基酸的缩合循环。这一过程不仅可以实现高度的可重复运作，而且操控十分简单，因此适配于自动化多肽合成平台。

（来源：Nature Chemistry）

实验结果表明，RMMR SPPS 方法能以高至 98% 的效率合成含 N-甲基和 α，α-双取代两类大位阻氨基酸的多肽序列。在多种常见的 N-甲基氨基酸/α，α-双取代氨基酸位置前后均可高效缩合不同性质的氨基酸，前/后相对位置不影响缩合效率；同时，序列中可连续或非连续地高效缩合多个大位阻氨基酸。该方法还首次实现了同时存在两种类型大位阻氨基酸的多肽序列的高效缩合，并以 90% 效率完成了难度极大的“Aib-NMeVal”型酰胺键的形成。

此次新技术在多种具有重要生理活性的大位阻多肽天然产物的固相合成中展现出色优势。例如，采用 RMMR SPPS 的 cyclosporin A 类似物合成范例显示，其中含有 7 个 N-Me 氨基酸的链状 11 肽粗产品的纯度可达 88%，分离纯化产率可达 70%，大大超越了现有文献报道的结果。范例中还包括了抗菌肽 alamethicin F 衍生物的 RMMR SPPS，该二十肽序列中包含了八个 α-甲基丙氨酸（Aib）残基，其机器自动化合成的粗产品纯度可达 88%，分离纯化后产率为 73%，结果相当惊艳。

总而言之，RMMR SPPS 创新技术籍由迭代科学思维，突破了 60 多年来传统固相多肽合成法无法克服的原理性限制，实现了温和条件下高空间位阻难合成肽链的高效组装，是一项在多肽固相合成和自动化合成领域具有里程碑意义的重大突破。RMMR SPPS 技术可望极大加速含有 N -甲基化和 α，α-双取代氨基酸的多肽药物探索，为未来口服及作用于细胞内靶点的肽类药物候选分子的发现和生物相容性材料的研究开发带来重大突破机遇。

审稿人评价称：“该概念简单且巧妙，依赖于一种量身定制的聚合物固体支持物，其中树枝状四价 HOBt 或 Oxyma® 衍生物被接枝到固体支持物的上游，用于锚定和延长待延伸的肽链的可裂解连接体。HOBt 衍生物和 Oxyma® 都是经典添加剂（或偶联剂如 HBTU 或 COMU 等许多其他偶联剂的亚组分），用于形成氨酰基活化酯，这些活化酯是当前大多数 SPPS 方案中酰胺形成偶联反应的反应物，通过 O-N 酰基转移从溶液相转移到生长肽链的固体支持胺中。”

审稿人还表示：“与使用传统 SPPS 方案相比，结果绝对令人震惊且具有说服力，当合成的肽含有 N-甲基化或季铵氨基酸时，其粗品纯度得到了显著且大幅度的提升。在我看来，这极有可能是几十年来 SPPS 领域为数不多的重大突破之一，其技术突破程度或许可与 Fmoc-SPPS 的发明或 ChemMatrix、PEGA 等极性树脂的开发相媲美。从这个意义上说，我认为这一新概念的发明非常具有价值且值得在Nature Chemistry这一顶尖化学期刊上发表。”

姚祝军表示，RMMR SPPS 不仅可以高效合成各种高空间位阻多肽，而且全面兼容现有 Merrifield SPPS 涉及的所有工作范围，包括自动化仪器平台，这两种技术在操作中还可以实现自由切换使用。因此，RMMR SPPS 的原理与技术在一定意义上可以称作是新一代或迭代固相合成技术。

RMMR SPPS 新技术将会在以下几个方面带来巨大机遇：1）肽药设计的范围将被拓展，将能触及到以前不可能获得的化合物禁区；2）现有具有先天缺陷的肽药将获得新的优化机会，比如提升药物口服利用度等；3）赋予研究者逐鹿肽类药物跨膜靶向胞内受体的各种机会；4）能够融合 AI 技术研制新一代 SPPS 自动化合成（实验室）仪器平台。

（来源：Nature Chemistry）

恶名昭著的头号“难肽”

多肽和蛋白质是生命体最重要的基础物质，其化学结构由各个氨基酸通过肽键（酰胺键）依次相连而形成。由于分子内和分子间的氢键等非键相互作用而发生局部结构扭转或形成折叠，最终成为各式各样具有不同三维结构的生理功能物质。肽类药物因其生物相容性等优势近年来受到重点关注且发展迅速，但同时也受到其固有的代谢稳定性和透膜性差的严重制约。研究显示，在肽骨架中引入 N-甲基或 α-烷基化氨基酸可明显改善化学稳定性和膜通透性，从而增强肽类化合物的“成药性”。当今风靡全球的降糖减重药物“司美格鲁肽（Semaglutide）”就是天然的人胰高糖素样肽-1（GLP-1，glucagon-like peptide-1）的结构修饰物，其中的化学改造就包括在结构中插入了一个 α-烷基化氨基酸（Aib,U）来延长代谢半衰期，由于效果极为明显其成为了一例新型长效的胰高糖素样肽-1 受体激动剂，被用于了成人 2 型糖尿病患者的血糖控制。

当前，绝大多数的多肽都可通过美国著名生物化学家布鲁斯·梅里菲尔德（Bruce Merrifield）于 1963 年首创发明的多肽固相合成法（SPPS，solid-phase peptide synthesis）制备获得，且可实现工业规模的自动化机器合成。Merrifield 因此也获得 1984 年诺贝尔化学奖。但是，Merrifield SPPS 固液两相间的传质效率十分低下，导致关键的酰基转移动力学性质较差，在技术上每步都需要使用大大过量的化学试剂和活化剂来帮助反应效率达标，经济性和绿色化学目标都非常不佳。并且，Merrifield SPPS 方法无法实现上述二类空间大位阻多肽序列的合成。过去六十多年间，一代又一代科研学者通过前赴后继的努力提供了无数的改进方案，均无法获得突破，空间大位阻多肽的固相合成成为多肽合成化学领域恶名昭著的头号“难肽”。该合成化学层面的长期困惑严重制约了现代新药研究和药物工业生产技术的前行步伐。为了解决这一问题，该团队开展了本次研究。

（来源：Nature Chemistry）

多肽合成化学“拔钉子”行动

据介绍，2019 年春由该团队的刘发博士和姚祝军作为课题发起人开始讨论多肽合成中公认的几个难题，该团队称之为多肽合成化学“拔钉子”行动。第一个目标就是大空间位阻多肽的肽键形成问题。他们认为传统技术的优化通道很窄，六十多年来有可能的改进都应该被研究过了，结论是至今无法突破。因此，该团队认为必须换思路、换赛道，于是开始有了模拟核糖体功能的想法。最后形成了类核糖体方案，提出了分子机器的概念。2019 年 9 月，魏思媛同学（本次论文第一作者）从中国农业大学毕业作为五年制免试直博生来南京大学报到，课题才正式开始启动。“期间，魏思媛同学展示了超强的学习和领悟能力、实验动手能力和结果分析能力，以及作为湖南妹子的坚忍和毅力。在她的不懈努力下，‘关关难过关关过’，最终课题获得全面突破。”姚祝军表示。

随后，他们在分子设计阶段拿出了好几套潜在方案，但其实他们并没有能力判断哪一种是最好的，只好由魏思媛自己挑一套开始。“记得她黯然无措了好几天，决定像摸彩票。”姚祝军回忆称。由于目前的理论性预测能力不足以支持前期预判，堆积“搬砖”工作量是唯一的途径。每一批数据出来之后，他们都要仔细分析规律，随后针对设计进行了一次次优化，然后继续验证……这个过程非常考验课题组的耐心，很多数据在出现时非常无序，他们的心情也随之高低起伏，有时候晚上焦虑实验结果而睡不着觉。经过四轮优化，终于获得了比较满意且符合规律的结果。“预期的分子机器概念曙光乍现，感觉像要开启成功之门了。”姚祝军说道。

接着，他们把经过优化之后的固载化 RMMR 分子机器用于“开/关”操作的动力学行为研究，确认了可操作性。然后，经过设定实验的对比，验证了类核糖体的酰基转移机制的真实存在；RMMR SPPS 具备普通多肽、长肽的合成能力，并与传统 SPPS 效果相当。然后，他们选择个别代表性高空间位阻多肽进行合成，并与传统 SPPS 进行了效果比较。结果非常令人欣慰，RMMR SPPS 显示出惊人的合成优势，甚至超越了该团队的预期。到此，该团队感觉他们已经胜利在望，或者已经处在“开创新纪元”的征程之中。随后的底物扩展性研究也非常顺利，范例一次次证明 RMMR SPPS 的惊人优势效果；机器自动化合成也非常顺利。“魏思媛和张徐纯同学自己修订了商品化仪器设备自带的程序包，在实验范例研究中获得了优异的效果。”姚祝军回忆称。

与此同时，在检验氨基酸消旋化程度的过程中，他们一度发现新方法在耦合组氨酸 His 时发生较为明显的消旋化，比传统 SPPS 要高出不少，显然这是非常不利的结果。为此，他们花了不少时间做各种尝试，最终发现 RMMR SPPS 和 Merrifield SPPS 条件之间是可以随意切换的，并不影响氨基酸耦合的效果。如此一来，他们采用按需切换条件的方式不仅解决了 His 偶联中少量消旋化的问题，还进一步展示了新技术的变通性和易操作性。“所谓，研究中出现的异常往往是又一次新的发现机会。”姚祝军表示。同时，该团队也为本次新技术申请了中国发明专利和国际专利的知识产权保护。

（来源：Nature Chemistry）

前面提到，研究者的毅力和坚持对于课题的成功是十分关键的因素。研究过程中大多数时间都是令人失望的结果，尤其在本次研究的初期充斥着体力和精神的双重煎熬。魏思媛（现已经博士毕业）在 2023 年秋季和姚祝军曾有过一次交流，那时研究工作大体已经成型，但尚需要征服个别公认的“硬骨头”，比如含有密集 N-Me 氨基酸的环肽药物——环孢菌素 A 的 RMMR SPPS 合成，如能攻克则可提升这一方案的科学高度。“但这样的话，她就有可能无法参加原定于 2024 年 5 月组织的毕业答辩。她希望就此打住。我拒绝了这一请求，并希望她突破这一难题。她当时情绪很大，半夜向父母哭诉，把她父母吓坏了……最终，她还是坚持住了，调整情绪投入到工作中。后来的实验工作表明，这一难肽的合成工作并没有想象中的艰难，RMMR SPPS 像一把神器，迅速破解了这一难题。”姚祝军表示。后来，魏思媛顺利按时完成了毕业论文答辩，并获得了答辩专家组全优的高度评价。“我也希望以此与读者们一起共勉，原创性研究工作不仅考验着研究者的智慧和实践能力，更考验导师和学生的精神毅力。”姚祝军总结称。

最终，相关论文以《固定酰基转移分子反应器可实现空间受阻肽的固相合成》（Immobilized acyl-transfer molecular reactors enable the solid-phase synthesis of sterically hindered peptides）为题发在Nature Chemistry，姚祝军和刘发担任共同通讯作者 [1]。

图 | 相关论文（来源：Nature Chemistry）

如前所述，该团队最初的开题讨论瞄准了几个长久没有克服的多肽领域合成化学难题，他们自己将这调侃为多肽合成化学的“拔钉子”行动。在开创 RMMR SPPS 概念并突破空间大位阻多肽的固相合成与自动化合成之后，他们希望进一步深化和延伸，争取拔除第二枚著名的”钉子”——易簇集多肽的固相自动化合成及产品分离纯化难题。二者的原理有所不同，但现有 RMMR SPPS 经变通发展有望解决第二个难题；目前，该团队这方面也已经取得了部分的阶段性进展。此外，该团队也在布局利用 RMMR SPPS 技术设计制造新型杂合形式的高空间位阻多肽，以达到优秀的细胞膜透性和代谢稳定性。所有这些努力将续写迭代 RMMR SPPS 的技术威力，以拓展具有重要生理学意义的多肽的自动化合成版图助力现代肽药研究。

参考资料：

1.Wei, S., Zhang, X., Yang, X. et al. Immobilized acyl-transfer molecular reactors enable the solid-phase synthesis of sterically hindered peptides.Nat. Chem.(2025). https://doi.org/10.1038/s41557-025-01896-8

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