这篇胆管癌单细胞+空转的40分+文章，几乎每一个图都是经典！富集分析更是惊艳！

胆管癌 (CCA) 代表着一种异质性恶性肿瘤谱，包括肝内胆管癌 (iCCA，10% 至 20%) 和肝外胆管癌 (eCCA，80% 至 90%)。eCCA 类别进一步细分为肝门部胆管癌 (eCCA-P) 和远端胆管癌 (eCCA-D)。临床试验中难以协调iCCA与eCCA之间的差异，主要由于对它们共同及亚型特异性细胞异质性的理解不足。

2025年6月，Journal of Hematology & Oncology杂志在线发表了来自海军军医大学东方肝胆外科医院王红阳院士与合作者团队的重磅研究成果：Deciphering cholangiocarcinoma heterogeneity and specific progenitor cell niche of extrahepatic cholangiocarcinoma at single-cell resolution，全面呈现了胆管癌（CCA）的单细胞概况，揭示了内源性胆管癌（iCCA）和外源性胆管癌（eCCA）亚型之间的分子异质性，为临床分层和功能精准肿瘤学提供了重要意义。

一．首先基于28例初治患者新鲜样本构建胆管癌单细胞图谱，涵盖炎症性胆道（iBT）、iCCA、eCCA-P和eCCA-D，共109,071个细胞。分析揭示不同亚型中细胞类型分布不均，如施旺细胞和肥大细胞富集于肝外病灶，iCCA中髓系细胞富集提示特有免疫微环境，eCCA-P中上皮与间质细胞比例失衡反映其硬化特性。

二．接下来先对癌细胞进行分析，通过NMF解析胆管癌（CCA）癌细胞的七个稳健元程序（MP），涵盖细胞增殖、DNA复制、衰老、代谢、抗原呈递、黏膜防御及干扰素应答。基于MP特征将样本分为四类分子亚型：增殖型、腺体型、干扰素应答型和衰老型。IFN应答亚型多见于eCCA，关联晚期分期、转移及不良预后；增殖型同样预后差，衰老型生存期较好。独立队列及ICGC数据验证了亚型分布及临床相关性，揭示了CCA的转录异质性与预后意义。

三． 鉴定出四种分子分型后，然后就筛选药物验证分子分型。利用16株未经治疗的CCA类器官（PDOs），并结合175种药物高通量筛选分析药物敏感性。结果显示，IFN应答亚型耐药性显著，衰老型和腺体型更敏感。PDO模型忠实保留肿瘤特征，证实分子分型可指导精准治疗。

四．继续在癌细胞上研究，鉴定出eCCA特异的基底样前体细胞亚群（c7），具有干细胞样特性，高表达KRT5、LY6D等基底-鳞状标记，并富集IFN应答通路。伪时间分析显示其位于分化起点。另外多队列（单细胞和单核细胞测序）验证发现Epi_05簇与c7一致，在肿瘤中富集并表现最高IFN应答活性。

五．筛选出来还不行，需要验证这类细胞是否存在，并在成瘤能力耐药方面进行验证。于是用多重免疫组化（mIHC）染色，在eCCA中鉴定并验证了LY6D⁺基底样前体癌细胞。LY6D⁺细胞在体外表现出更强的类球形成能力和干细胞/基底细胞基因上调，并在体内形成更大肿瘤，且与IFN应答型PDO亚型耐药性一致。

六．分析完了癌细胞，接下来看微环境中的间质细胞。鉴定出CCA间质细胞8个亚群，包括5类成纤维细胞和3类周细胞。iBTs富集良性及炎性成纤维细胞，CCA特有三类CAFs具不同功能。eCCA-Ps富集炎性周细胞和肌周细胞，eCCA-Ps/Ds富集高表达干扰素刺激基因的周细胞，并与mEPC簇通过EDN1-EDNRA/B信号强相互作用。

七．癌细胞和间质细胞分析完后，又绘制CCA免疫图谱，鉴定出多种单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及T/NKT/NK细胞亚群。eCCA特有Macro_ISG15巨噬细胞和CD8T_ISG15细胞均高表达干扰素刺激基因，与预后不良相关。iBTs富集MDSC样单核细胞，CCA中M2型及TAMs更常见，并揭示多类T细胞功能状态及关键细胞间信号互作。

八．最后一张图总结了微环境细胞中ISG15高表达和eCCA的肿瘤耐药直接的联系（空间组和体外实验）。eCCA 中存在 LY6D⁺ 基底样前体细胞，周围伴有 ISG15 高表达的周细胞、巨噬细胞和 CD8⁺ T 细胞形成特定微环境。ISG15 与基底及干细胞标记物高相关，可增强癌细胞成球能力，并显著提高对顺铂、吉西他滨、5-FU 等药物的耐药性，提示其在维持肿瘤干性和化疗抵抗中具有重要作用。

本研究构建了胆管癌（CCA）的单细胞图谱，揭示了iCCA和eCCA在细胞组成和分子机制上的显著差异。特别发现eCCA特异性的LY6D+基底样祖细胞群，依赖ISG15富集的肿瘤微环境维持干性和耐药性。ISG15信号通路在促进祖细胞存活和药物抗性中起关键作用，揭示了新的预后标志物和精准治疗靶点，为胆管癌的临床诊断和治疗提供了重要依据。

顺便提一下这篇分析中提到了CytoTRACE方法，CytoTRACE（利用基因计数和表达进行细胞轨迹重建分析）是一种基于单细胞RNA测序数据预测细胞分化状态的计算方法。有兴趣的朋友可以学习一下（https://cytotrace.stanford.edu/）。