tLNP: 细胞治疗进入大分子时代？

2017年8月，诺华的CAR-T药物Kymriah获FDA批准，用于治疗复发/难治性B细胞急性淋巴细胞白血病，完全缓解率达83%，首次实现“活细胞药物”商业化。

截至目前，全球获批的细胞疗法一共有42种，其中免疫细胞疗法15种，干细胞疗法27种。

尽管细胞疗法，特别是CAR-T，无论在临床还是商业化上都取得了相当的成功，但由于高昂的价格、复杂的生产工艺、使用的不便宜性，限制了其在更大范围的应用。

当自体CAR-T在血液瘤治疗上取得重大突破后，业内立即将目光投向了异体通用型CAR-T。但患者对于异体CAR-T的免疫排斥（HvG）始终是困扰业界的一大难题。至今，除了邦耀通过多基因编辑产生的通用型CAR-T（TyU19）在自免疾病患者治疗上取得一定突破外，其它公司尚未在临床上取得实质性突破。

近几年，通过将CAR-T基因直接递送到患者体内并表达在T细胞表面的In vivo CAR-T技术正悄然兴起，而这些技术的领导者主要是欧美的初创型Biotech（表1），其中已有多家被MNC看中，或合作或被收购。国内方面，博生吉、沙砾、易慕峰、云顶新耀等企业也已做了深入布局。

表1. 不同In vivo CAR-T公司列表

从技术上来看，目前的In vivo CAR-T按递送方式可以分为病毒及纳米颗粒两大类（表1）。

其中病毒递送又以慢病毒为主，已有多款In vivo CAR-T进入临床试验。近日，EsoBiotec公布了其ESO-T01（图1）的临床1期试验早期数据。

图1. ESO-T01结构示意图

首批4位患者在疗效方面，1例患者在输注后第28天骨髓中的肿瘤病灶和恶性血细胞完全消失，另1例患者在治疗后两个月达到相同效果。其余2例患者获得部分缓解，表现为病灶缩小和癌细胞减少。安全性数据显示，4例患者接受单次ESO-T01输注后均出现不同程度不良反应：所有患者在输注当日均出现寒战、发热等急性炎症反应，其中3例出现需药物干预的低血压症状。

慢病毒递送CAR-T的优势在于：1）将CAR基因整合至宿主T细胞基因组中，保障CAR蛋白长期稳定表达，使CAR-T细胞能够持续发挥抗肿瘤作用，达到传统CAR-T的效果。2）相比γ-逆转录病毒只能感染分裂细胞，慢病毒可有效感染处于静止期的T细胞，适用于T细胞早期状态，能够对更多的T细胞进行改造，提高治疗效果。3）能携带约8kb外源序列，适合构建多靶点、装甲化CAR结构，为CAR-T细胞的设计和功能多样化提供了更多的可能性。

但其缺点也比较明显：1）慢病毒本身具有一定的免疫原性，可能会引发机体的免疫反应。一方面，患者体内可能预先存在针对慢病毒的中和抗体，这会降低病毒载体的感染效率，影响CAR-T细胞的生成；另一方面，免疫反应可能会导致炎症等不良反应，影响治疗的安全性和有效性。2）慢病毒的随机整合可能会导致插入突变，干扰宿主基因组的稳定性，增加继发性肿瘤发生的几率。3）慢病毒载体的生产需要专业的技术和设备，生产过程较为复杂，包括病毒颗粒的包装、纯化等环节，对生产环境和质量控制要求很高，这使得慢病毒体内CAR-T疗法的生产成本较高。

而使用纳米颗粒，特别是脂质纳米颗粒（LNP），作为递送载体的技术方式相较于慢病毒具有一定优势：1）LNP递送的mRNA不整合基因组，仅短暂表达（数天至1周），可避免长期毒性，如插入突变、持续免疫激活等。此外，可多次给药调节疗效，能减少细胞因子风暴的风险。2）LNP作为已经获得FDA批准的递送系统，可标准化生产，不依赖于细胞体系，便于放大。3）LNP的脂类化合物具有良好的生物相容性，其表面的PEG修饰脂质可阻碍单核巨噬细胞的摄取和血清蛋白的黏附，减少免疫原性，有助于减少非特异性免疫反应，从而促进更精准的抗原特异性免疫应答。4）LNP的降解产物为无毒的小分子物质，能够通过代谢途径排出体外，确保了其在体内的安全性。

因此，我们可以把利用LNP作为载体通过靶向免疫细胞递送CAR-T mRNA的药物（tLNP）看作是一种大分子药物，甚至是一种ADC药物，而这类ADC的Payload就是包含mRNA的LNP。

目前tLNP比较有代表性的产品有Capstan的CPTX2309及NanoCell的NCtx-CD19（图2）。

图2. （A）CPTX2309；（B）NCtx-CD19结构示意图

tLNP作为一种ADC，可以拆解为三个主要元件：1）抗体；2）LNP；3）mRNA。而这三个元件的设计、优化及组合将决定产品能否取得临床及商业化成功。

1、抗体

如果靶向T细胞，可供选择的抗体靶点包括CD3、CD5、CD7、CD8、TCR等。而这些靶点如何组合？抗体如何选择亲和力及Epitope?抗体选择什么样的Format（IgG、VHH、scFv、Fab等）？这些设计将决定tLNP的靶向特异性及T细胞激活的强度及持久性，也在一定程度决定了药物的疗效及安全性。

2、LNP

传统LNP最大的局限是易于在肝脏聚集，主要原因是LNP的脂质组成及表面电荷使其吸附血液中的脂蛋白与肝脏中的脂蛋白受体结合而聚集。

LNP由四种成分组成：1）阳离子脂质；2）磷脂；3）胆固醇；4）PEG-脂质（图3）。

图3. LNP结构示意图

其中，阳离子脂质是LNP递送系统中最关键的组分，决定了递送效率和转染效率。胆固醇在LNP中起到稳定纳米颗粒结构、促进mRNA胞内摄入和胞质进入的作用。磷脂有助于mRNA的封装、稳定脂质双层结构、提高mRNA递送效率。PEG-脂质可以提高纳米颗粒的整体稳定性，延长纳米颗粒在血液中的代谢时间。

通过调整脂质化学结构、成分及剂型来优化LNP，降低其肝脏靶向性并对富含T细胞的脾脏（或其它免疫组织）具有更好的靶向性，同时增强血液稳定性，是tLNP的主要研究目标。

Capstan的创始人之一，美国宾大的Michael J. Mitchell教授团队，通过合成252种含硅氧烷的类脂质，发现负电荷脂质能增强脾脏递送。从Capstan已公开的专利来看，CICL-1（US20230320095A）和CICL-207（US2025127728A1）两款阳离子脂质对脾脏有较好的靶向性（图4）。

图4. CICL-1及CICL-207结构示意图

此外，在Capstan专利（WO2023196445及WO2024249954）中分别对PEG-脂质进行改造修饰以提高转染效率及连接CD47多肽，从而降低巨噬细胞的识别以提高生物利用度。

另外，LNP的粒径影响其内化、生物分布、免疫原性、降解和清除，通常LNP的最佳粒径范围为20-200nm。通过优化LNP各组分的比例和种类，可提高LNP的稳定性和对mRNA的保护作用。

因此，对于LNP脂化学结构及制剂的不断优化改造将是未来tLNP主要研发方向之一，也将是各家公司不同产品的主要差异化点。

3、mRNA

作为递送入细胞进行转染的mRNA，面临稳定性、免疫原性及转染效率等诸多挑战。

多年研究发现，可以通过用人工合成的非天然核糖核酸替换天然核糖核酸来合成mRNA，如使用假尿嘧啶核苷（Ψ）替代尿嘧啶核苷，可减少模式识别受体（PRRs）的激活，降低免疫反应，增强mRNA的翻译效率和稳定性。

用常见密码子替换稀有密码子可以增加mRNA翻译水平，提高mRNA的稳定性和翻译效率。增加GC含量也可以提高mRNA翻译水平并降低免疫原性。

5'帽结构是mRNA翻译和蛋白质生产的重要识别位点，其完整性对mRNA的稳定性至关重要。3'多聚A尾的缩短会导致mRNA降解速率加快，因此要保证3'多聚A尾的完整性和适当长度。

在5′UTR之后引入Kozak共识序列可提高稳定性和翻译起始水平。选择人α珠蛋白和β珠蛋白3′UTR序列可显著提高mRNA的稳定性和翻译效率。在编码序列和多聚A尾部之间以头尾方式引入两个β珠蛋白的3′UTR序列，能进一步提高mRNA的稳定性和翻译效率。

而NanoCell等公司选用的环状RNA既无5'帽结构也无3'多聚A尾，在稳定性、免疫原性、生产成本等方面相较于传统线性mRNA具有一定优势，但在环化效率、纯化、表达调控等方面仍具挑战（图5）。

图5. 线性及环状mRNA对比

随着tLNP CAR-T陆续进入临床，这种In vivo CAR-T技术将面临有效性、安全性及持久性的考验。如何优化T细胞靶向特异性？如何找到合适的转染效率？如何降低免疫原性？如何确定合适的给药剂量及给药周期以实现长期药效？与传统CAR-T相比，In vivo CAR-T的胞内共刺激信号是否需要进一步优化？等等，这些问题将是tLNP产品不断优化并在临床上取得验证的重要方向。

tLNP作为一种颠覆性技术，一旦在临床上取得突破，将意味着细胞治疗进入大分子药物时代。

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