单克隆抗体表位鉴定技术在抗体药物研发中的应用

中文摘要

单克隆抗体药物因其特异性高、靶向能力强、不良反应小等特点，成为目前生物医学领域的重要研究方向。表位作为抗体识别抗原的特殊区域或结合位点，其有效鉴定对药物发现和设计至关重要。此文主要对抗体表位的X射线晶体学、噬菌体展示技术、ELISA等方法的研究进展进行介绍，阐述其相关原理、特点及应用。

正文

近20年，抗体药物迅速发展，挽救了很多癌症晚期患者的生命 。从1986年第1个治疗性单克隆抗体（单抗）药物muromonab-CD3获批至今，全球已经有229种抗体药物成功上市（包括上市后退出市场产品），治疗性抗体药物也是目前生物学、医学领域的重要研发项目之一。抗体不仅具有结合抗原和内源性受体的能力，而且可以通过蛋白质工程开发衍生药物，如双特异性抗体、抗体偶联药物、核素偶联药物、纳米抗体和其他抗体类似物等。在开发抗体及其衍生物等大分子药物设计过程中，应考虑诸多因素，如靶向抗原序列、抗体-抗原亲和力、连接蛋白和抗体亚型等的影响。抗体功能取决于其与抗原结合表位，不同表位结合发挥特定的功能。单抗的表位分析能促进治疗性抗体的发展、疫苗设计、抗菌药剂的开发等。随着抗体技术发展，鉴定抗体表位的重要性也在增强。本文就单抗药物的结构生物学、功能筛选、生物信息学预测等方法的原理、特点及研究进展进行综述。

1

结构生物学方法

1.1

X射线晶体学

1957年，X射线首次被用于观察抹香鲸肌红蛋白的三维结构，自此，X射线晶体衍射技术逐渐成为研究生物大分子空间结构的重要手段。在晶体形成过程中，当纯化至均一的蛋白质溶液达到过饱和状态时，随机无序的蛋白质分子会转变成有序结构并从溶液中析出，这个过程就是蛋白质结晶；对大分子蛋白质，需要浓缩至尽可能高的浓度且不能发生沉淀或聚集，后续采用蒸汽扩散、透析等方法促进大分子结晶。X射线与蛋白质晶体相互作用形成有序分布的斑点衍射图像，在各个方向上均匀衍射，衍射数据可采用软件程序处理，确定在某一方向上蛋白质晶体的振幅和相位、计算结构因子，通过快速傅里叶变换重建电子密度图，后续细化电子密度图，模拟构建合理的氨基酸侧链类别，细化确定抗体表位序列。在X射线晶体学方法中生成共晶十分重要，这就对抗体和抗原的纯度提出高要求，也是目前X射线晶体学发展的限制因素。

Orth等应用X射线晶体学分析艰难梭菌外毒素B组合重复寡肽结构域的N端结构与贝佐妥单抗Fab片段结合形成的晶体结构，验证贝佐妥单抗通过阻断毒素与宿主结合发挥中和作用，可用于预防复发性艰难梭菌感染。Obmolova等应用该技术，将2种抗CD27中和单抗与CD27结合，使CD27与抗体的Fab片段形成三元复合物晶体结构，从而鉴定2种单抗表位不同的中和机制，揭示了抗体结合模式及CD27中和表位依赖性机制，对开发基于CD27的自身免疫性疾病治疗方法具有重要作用。

1.2

氢氘交换质谱（hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry，HDX-MS）

大分子复合物的高分辨率三维结构揭示了蛋白质的静态结构，但蛋白质是不断运动的动态分子，这些动态重排过程对蛋白质的功能同样重要。细胞中蛋白质功能发挥需要原子或结构域的协调运动，即构象动力学。HDX-MS的核心原理是蛋白质中氢键可以与氘溶剂发生交换反应。蛋白质中主链酰胺键虽有稳定的氢键结构（如α螺旋、β折叠），不易与氘溶剂发生交换反应，但随着时间推进，所有主链酰胺最终都会暂时暴露在氘溶剂中并与之交换，整个过程可通过质谱法进行检测。HDX-MS交换反应通过调节pH和温度，将氘冷冻到酰胺键位置上，再通过质谱法量化氘的吸收，比较蛋白质不同区域的氘摄取水平，以此获得系统中构象动态变化信息。主链酰胺键上的氢更多地暴露于氘溶剂中，比封闭在蛋白质核心中的氢交换速率更快。还可通过蛋白质酶切产生多肽片段，采用质谱仪鉴定肽段的质量，确定溶剂吸收随时间变化，最后通过计算机软件绘制氘摄取图并映射到已知晶体复合物上进行表位分析。HDX-MS技术应用的前提是目标分析物在溶液中能稳定、均匀存在，目前该技术广泛用于分析复杂的蛋白质系统，揭示了蛋白质动力学、折叠途径以及配体间相互作用。借助高分辨率的质谱仪，HDX-MS技术取得了进步，并降低了适用门槛。

Gramlich等通过HDX-MS技术获得治疗性抗体与抗原结合的表位结构信息，从而确定了抗钙结合蛋白膜联蛋白A1抗体的抗原结合表位，发现抗体结合域与Ca2+紧密相关，说明钙结合蛋白膜联蛋白A1的功能和结构在细胞内受到Ca2+调控，有助于后续提高抗体的疗效和安全性。Lin等研究了大肠埃希菌中的外膜维生素B12转运蛋白BtuB系统，B12可以在氢氘交换过程中作为终止剂打破盐桥结构终止交换，从而实现BtuB控制氢氘交换，为未来在天然细胞环境中进行HDX-MS研究提供了可能性。

1.3

冷冻电子显微镜技术（cryo-electron microscopy，Cryo-EM）

1931年，Knoll和Ruska制造了透射电子显微镜，首次使生物体单个细胞器的形态可视化，在随后几十年里为细胞和分子生物学做出了巨大贡献。早期Cryo-EM主要由冷冻透射电子显微镜获取数据，随着显微镜、样品制备仪器和样品制备方法的进步，Cryo-EM现在可以通过冷冻扫描电子显微镜、聚焦离子束、微晶电子衍射等方式获取数据，从仅能确定大分子结构进化到确定原子细节结构。Cryo-EM主要过程为将生物标本快速玻璃化冷冻，让样品在近乎天然状态下固定；使用电子探针对玻璃化样品进行三维结构成像处理，用电子晶体学、单颗粒分析和电子断层扫描3种方法进行解析。X射线晶体学虽然一直是揭示生物分子原子分辨率结构的首选方法，但该法需大量纯净、稳定和均匀的样品，不需要形成晶体的Cryo-EM可作为高分辨率X射线晶体学的替代方法。

Xu等采用Cryo-EM分析成纤维细胞活化蛋白α（fibroblast activation protein alpha，FAP）与单域抗体I3的独特结合表位，首次揭示了FAP-I3相互作用所必需的重要残基，对新型单域抗体从头设计提供科研基础，后续可将FAP作为纤维化、关节炎和心血管疾病等多种疾病的治疗靶点，帮助开发治疗诊断试剂。

2

功能筛选方法

2.1

ELISA

ELISA通常利用酶化学发光或荧光技术来鉴定样品，使用分光光度计通过吸光度值或荧光信号强度计算结果，主要包括直接、间接、夹心和竞争ELISA。在实验过程中，应考虑抗体的浓度、固相结合能力等因素。直接ELISA依赖酶偶联的一抗与包被抗原的结合；间接ELISA引入与包被抗原结合的一抗和特异性的酶联二抗；竞争ELISA中待测抗原和包被抗原之间竞争结合一抗，用酶联的二抗检测；夹心ELISA在抗体预包板中引入待测抗原，检测抗体和酶联二抗结合抗原识别位点。ELISA操作简单，在表位鉴定分析时，可将大分子蛋白质通过计算机预测制备成多种可能性的高结合多肽，检测其与抗体结合的亲和力大小，从而确定表位。

Shi等利用ELISA鉴定柯萨奇病毒A组16型（coxsackievirus A16，CV-A16）中和表位序列，筛选包含CV-A16衣壳蛋白1的95种合成肽，根据产生的反应性，成功筛选出15种高结合肽，最终整合序列后发现6种无重叠的多肽，即6个中和线性表位。后续可针对上述筛选结果开发具有广泛保护作用的CV-A16疫苗。Kaneko等开发了抗人端粒逆转录酶单抗，经点突变合成一系列长302~320氨基酸的人端粒逆转录酶多肽，通过ELISA利用成功开发的单抗检测上述多肽，分析结合能力强弱从而获得单抗结合的关键表位，为后续弥漫性胶质瘤抗体开发提供新靶点。ELISA在应用过程中，由于抗原分子较大，分析筛选的合成肽组合较多，工作量较大，且在肽段合成过程中构象表位可能被切割、变性条件及表位自身裂解等改变原有构象，因此该方法主要用于筛选线性表位，不适用于构象表位筛选。

2.2

噬菌体展示技术

利用噬菌体文库筛选与抗体结合的多肽或片段，从而预测抗体表位，这种方法可用于高通量筛选候选表位。1985年，Smith成功将外源DNA整合到M13噬菌体的染色体中；外源肽与噬菌体的G13P外壳蛋白融合，蛋白表型（展示的肽）和基因型（编码展示肽的DNA）在噬菌体展示系统中建立物理连接，可快速筛选出具有所需特性的蛋白质。之后该技术被用于数百种研究、诊断和治疗用抗体表位的鉴定，其中包括超过14种获得临床批准的抗体。噬菌体展示技术成功的关键在于文库的质量和选择策略，抗体噬菌体展示文库分为天然文库、合成文库和半合成文库3种。噬菌体展示文库筛选也称为亲和选择（生物淘选），主要过程为：将抗体轻链和重链的可变区整合到噬菌体染色体上，转染大肠埃希菌宿主细胞并生成噬菌体文库，随后利用固相基质等手段进行筛选；具有特异性结合能力的噬菌体被大量繁殖、富集，通过DNA序列分析，定位该噬菌体所携带的外源肽序列，从而获知该抗体所识别的抗原表位序列。与传统方法相比，经典噬菌体展示技术的优点在于：快速、简单、低成本，可在噬菌体表面显示丰富多样的蛋白质文库等；另一方面，由于衣壳蛋白是噬菌体生长所必需的，因此对蛋白质排列变化有很大限制；而插入的外源DNA长片段比正常噬菌体DNA大得多，稳定性较差且繁殖速度较慢。该技术还有许多不同且复杂的替代形式，如使用杆状病毒MHC/肽展示文库可以筛选大分子蛋白质。目前，噬菌体表面疏水肽的产生和呈递或重组蛋白形成聚集体的问题仍未解决。

O'Nuallain等通过对小鼠注射Len蛋白获得单抗11-F4，并使用随机肽噬菌体展示技术将野生型和丙氨酸突变型的Len蛋白和11-F4表位作图，确定抗体结合位点在前18个氨基酸内。实验结果分析表明单抗的特异性主要取决于7、8位的脯氨酸，11-F4相关模拟表位的鉴定可促进轻链纤维反应性抗体的开发，用于诊断和治疗淀粉样变性患者。

2.3

丙氨酸扫描技术

虽然蛋白质与蛋白质的相互作用已经可以通过物理学方法解析得到大量高分辨率结构，揭示许多表位细节，但不能全面了解结构表位中残基的影响，而定点诱变是探测蛋白质结构与功能的有效工具。采用丙氨酸取代待测氨基酸残基，通过观察蛋白质功能变化，可推断目的残基对蛋白质结构与功能的影响，缺点是丙氨酸扫描筛选费时费力，且需要生产和纯化大量突变蛋白。经典的丙氨酸扫描方法可通过2种互补的扫描策略——丝氨酸扫描和同源物扫描，进一步提高功能表位分析的分辨率。在极性溶剂中亲水性丝氨酸相比疏水性的丙氨酸对待测侧链结构影响更小；同源物扫描目的在于替换氨基酸时，为使对结构造成的破坏最小，选择与原本氨基酸最佳替换的同源物。通常进行结合表位分析时，全面扫描工作量极大，需要先推测哪些残基在诱变时提供的信息最有价值，一般不用于没有数据基础的实验。

Li等利用之前开发的识别上皮细胞黏附分子的单抗EpMab，通过丙氨酸扫描的方法确定关键表位，以丙氨酸残基替代上皮细胞黏附因子蛋白关键表位合成突变体R163A；用流式细胞术确定单抗能否识别突变体R163A，结果表明抗体的关键结合表位位于Arg163。

3

生物信息学预测

蛋白质结构数据库包含了大部分已知蛋白质的二维和三维结构数据，国际免疫遗传学信息系统汇集了针对免疫系统抗体相关蛋白的综合知识资源。任何蛋白质三维结构的折叠构象都可以通过蛋白质结构指纹图谱来表达，这项技术也是较为常用的预测手段。从2005年开始，英国牛津大学Nucleic Acids Research期刊与加拿大不列颠哥伦比亚大学生物信息学中心合作，整合完成生物信息学资源列表，其中免费可用的生物信息学研究软件、数据库可用于预测蛋白质三级结构、序列特征检测等。2022年英国DeepMind公司发布用于解决蛋白质折叠问题的AlphaFold2软件并开源，AlphaFold2模型和其他预测结构都包含在蛋白质结构数据库中，以图片形式说明了实验结构和计算机模型之间的互补性，后续AlphaFold3软件对跨膜蛋白模型、新型原核蛋白家族不断更新，取得了重要进展。AlphaFold3在AlphaFold2软件基础上，进一步提高蛋白质结构预测的准确性和效率，特别在处理复杂多聚体结构和动态分子建模方面展现出显著优势，帮助研究者在原子水平上精确地观察生物系统结构，为寻找新靶点和设计新的治疗性抗体提供可能性。快速、高效的结构设计模型与AlphaFold3对设计序列的精确验证相结合，开辟了蛋白质功能设计的新时代，可根据需要的功能从头开始设计蛋白，而不需改变现有蛋白质序列结构来设计所需功能。利用软件算法，根据抗体和抗原的序列信息可预测抗体抗原结合关键表位，省时且成本较低。虽然这种技术可以快速筛选候选表位，但结论需进一步通过实验证实，只能作为辅助工具在研究前使用。

Negi与Braun开发了EpiSearch算法，从噬菌体展示序列绘制蛋白构象表位，对所有噬菌体展示序列自动分析预测蛋白质的构象表位；对曲妥珠单抗表位进行作图分析，通过噬菌体展示技术分离12个多肽，通过软件预测表皮生长因子受体2的高结合区域分布在200—300和550—600位氨基酸区域，计算得565处结合度最高，与实验确定的抗体表位表皮生长因子受体2复合物一致，后续对6个独立中和表位进行性能分析的结果基本和已知表位重叠。Liang等开发了抗体设计软件IsAb2.0，整合蛋白质复合物预测模型AlphaFold-Multimer用于建模，采用Flex ddG方法进行计算机抗体优化，已被应用于防治HIV-1感染，目的是将抗体J3人源化为HuJ3以降低免疫原性。研究者通过IsAb2.0设计HuJ3，并增加其对包膜糖蛋白120的结合亲和力，发现5个可能增加结合亲和力的潜在突变，后续ELISA结果表明其中E44R突变可以增加结合亲和力。

4

展望

单抗具有靶向性，与小分子药物相比毒性更小。抗体疗法已经被批准用于至少162种靶点和疾病，成为生物制剂行业支柱产业。抗体表位复杂多样，有效靶点的正确解读对抗体的应用至关重要。结构生物学方法可通过解析高分辨率抗体与靶标分子的结构信息，分析确定抗体的结合位点和表位；功能筛选方法可直接筛选出具有特定功能的抗体表位，加深对抗体与靶标分子相互作用的理解，加速筛选具有特定表位的抗体；生物信息学方法的应用为抗体表位鉴定带来新的突破，通过结构生物学得到的高分辨率的三维立体结构与高通量筛选得到的数据结合分析、建立算法模型，预测抗体与抗原之间的相互作用，加速抗体研发的过程。不同作图方式的表位信息在范围和分辨率上有所不同，通常使用多种作图方法来获取补充或支持数据。

鉴定疾病重要生物标志物的抗体结合区域或表位，对疾病诊断、疫苗开发和阐明疾病机理具有重要意义。表位图谱通过确定氨基酸序列及其三维相互作用，能直接揭示抗体或其衍生物与特定抗原的亲和力大小。表位图谱还有助于研究人员研究特定表位的结合从而改变蛋白质功能。抗体表位鉴定技术也可以与其他方法，如蛋白质工程和高通量筛选技术等结合，从而设计和优化具有更强结合能力和特异性的抗体。抗体表位鉴定技术也可以用于疾病的诊断和治疗，通过识别和鉴定保护性抗体靶向的表位，可促进疫苗和抗体疗法的开发，甚至可直接用于治疗性抗体开发，针对如狂犬病、炭疽病、乙型肝炎等，还可以指导亚单位疫苗的设计，包括保护性表位设计，开发出更有效的疫苗。总之，随着科学技术的不断进步，抗体表位鉴定技术会取得更大的突破，为疾病的治疗和预防提供有效的手段。

作者

赵美依1综述 马雷钧2审校

1上海生物制品研究所有限责任公司第四研究室，上海 200051；2上海生物制品研究所有限责任公司质量检定室，上海 201403

通信作者：马雷钧，

Email：maljsibp@163.com

引用本文：赵美依, 马雷钧. 单克隆抗体表位鉴定技术在抗体药物研发中的应用 [J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(3): 219-224.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20240726-00051

识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入

生物制品微信群！

请注明：姓名+研究方向！

本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观不本站。