动物行为实验指南丨领结形迷宫(The bowtie maze)实验方法

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领结形迷宫(The bowtie maze)巧妙地融合了标准物体识别测量方法中最突出的特点，特别是延迟非匹配样本任务和自发探索。

关于自发识别和工作记忆的研究在很大程度上依赖于动物实验，依靠诸如延迟非匹配样本（DNMS）任务以及新物体偏好测试的各种变体等测试方法。这些开创性的测量方法通常通过呈现一对物体来研究识别记忆，并且当动物成功区分出新物体和熟悉物体时给予奖励。与此同时，新物体偏好（NOP）测试利用行为观察，即在啮齿动物在开放场地中自由探索和研究这对物体时进行观察。研究已经证明了这类测试的有效性；然而，也发现了一些局限性，比如训练过程困难、表现水平不稳定，以及容易受到较大变异性的影响。为了应对这些挑战，领结形迷宫通过每次实验提供多次试验来进行充分的训练，其识别测量方法牢牢基于啮齿动物对新奇事物的先天偏好探索。

在领结形迷宫中进行的实验包含多次试验，在试验过程中，啮齿动物首先会接触到一个单一的样本物体，然后它们的任务是在迷宫中来回穿梭时，逐步区分同时遇到的成对物体。通过这种方式，每个新物体在接下来的成对物体中就变成了熟悉物体。这种创新的迷宫设计使啮齿动物能够在一次实验中高效地完成多次物体识别试验。此外，多次试验有助于减少自发识别任务中的变异性。简单的行为模式（在同一装置中来回穿梭）也使得除了视觉之外，还能测试其他感觉模态，从而探究感觉系统之间的相互作用。对记忆保持间隔以及延迟对识别的影响的研究，在一次实验中也更容易观察到，而且无需将啮齿动物从装置中移走。与标准物体识别任务不同，在领结形迷宫中，强化并不直接指导识别表现，而只是起到鼓励探索的作用。由于测试的有效性高度依赖于对测试物体的差异探索，新物体和熟悉物体都放置了诱饵。具体来说，啮齿动物选择新物体不会得到奖励，而是因为在领结形迷宫的两端来回穿梭而得到奖励。

装置与设备：

该测试使用一个领结形状的迷宫，迷宫的两端呈三角形，在装置中间两个顶点相接的地方有一个小隔板将两端隔开。每个三角形的远端墙壁上有两个凹陷的食物槽，物体就放置在这些食物槽上。一个不透明的墙壁隔板将食物槽隔开。

迷宫通常由有机玻璃制成墙壁和地板，连接通道中间有一个不透明的隔板。每次试验后，通常会将门移开，以便啮齿动物能够穿过迷宫到达另一侧。

Fig1 领结形迷宫示意图

一扇滑动门将迷宫的两端隔开，两端各放置有两个物体。（B）展示了标准物体识别任务中物体呈现顺序的一般流程。所有物体都设有奖励（+）。（箭头）表示大鼠的移动方向。（黑色字体）代表新物体，（灰色字体）代表熟悉物体。

训练方案：

对啮齿动物进行禁食，使其体重降至自由进食时体重的85%，并维持在这个水平，同时保证有水供应。在实验开始前，要让啮齿动物充分适应被人处理。

在预训练的第一天，将啮齿动物两两一组放入装置中20分钟。在每次实验中，让它们自由探索迷宫。在这个初始阶段，食物颗粒被散落在装置的地板上和食物槽中。在预训练的第二天，每次将啮齿动物单独放入装置中10分钟，并且只在食物槽中放置诱饵。

在第三天，每10分钟就不断地在食物槽中重新放置诱饵，以奖励在装置中来回穿梭的啮齿动物。中间的隔板用于控制在迷宫中的移动。在这个阶段，还训练啮齿动物移动物体以获取食物槽中的食物。具体做法是，首先将物体放置在只部分遮挡食物槽的位置，以便能看到奖励，然后逐渐移动覆盖食物槽的物体，直到食物槽完全被遮住。在为期7天的预训练结束时，一旦滑动门打开，啮齿动物应能迅速从迷宫的一侧移动到另一侧，并且能轻松地移动物体以获取食物奖励。预训练期间使用的物体不能用于正式测试。

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领结形迷宫实验步骤：

在领结形迷宫中进行的标准物体识别实验，每次实验包含20次试验，在此期间，啮齿动物每次可以自由探索两个物体，一个是新物体，一个是熟悉物体。实验开始时，将啮齿动物放置在迷宫的一端，在这一端只呈现一个样本物体（物体A），它盖住了一颗食物颗粒。啮齿动物在迷宫的这一侧停留1分钟，之后滑动门打开，啮齿动物会冲到迷宫的另一侧。

移动到迷宫的另一侧标志着第二次试验的开始。在这个阶段，啮齿动物需要在两个物体中做出选择，一个是新物体B，另一个是现在已经熟悉的物体A。两个物体都盖住了食物颗粒。在移开一个物体并获取食物奖励后，滑动门打开，啮齿动物又冲回迷宫的另一侧进行第三次试验，在这次试验中，物体B与一个新物体C一起呈现。啮齿动物再次做出选择，然后进入下一次试验。这个过程一直持续到完成20次试验，并且呈现了21对物体。

物体的左右放置顺序是伪随机的。对于一半的实验对象，物体的顺序是相反的。领结形迷宫还可进行修改，以方便地实现单次实验内长达24分钟的记忆保持延迟，以及实验间长达3小时和24小时的延迟。

行为分析：

将啮齿动物对物体的探索操作定义为将鼻子指向距离物体不到1厘米的地方。行为观察包括动胡须以及用鼻子或爪子触碰物体。

测量专注于新物体的探索时间减去专注于熟悉物体的时间，即D1。第二个测量值D2是通过计算新物体和熟悉物体的探索时间差（D1），然后将该差值除以对两个物体的总探索时间来确定的。得到的D2值是一个介于+1和-1之间的比率，其中正值表示对新物体的偏好，值为零表示没有偏好。

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总结：

领结形迷宫满足了在识别记忆领域中对新的、复杂测试程序的需求，这些测试程序能够补充传统的延迟非匹配样本任务和新物体偏好测试。与传统的延迟非匹配样本任务相比，领结形迷宫和新物体识别测试能够在对预训练要求不那么高的情况下，对物体识别能力进行有力的评估。

领结形迷宫的实验程序允许更高效的测试过程，每次实验有20次试验的标准，消除了每次试验后都要将啮齿动物从装置中移走的麻烦。除了效率高之外，20次试验的实验也确保了更显著的效应量。此外，通过在所有物体上都放置食物颗粒作为诱饵，对物体探索进行强化，而不是对新物体偏好进行强化，确保了奖励不会指导辨别表现。

领结形迷宫的另一个优点在于，它能够测试标准自发识别任务中无法测试的识别方面。一个例子是遗忘曲线的记录，领结形迷宫通过单次实验内和实验间的测试能够更准确地呈现遗忘曲线。此外，将每个物体既用作新刺激又用作熟悉刺激，也有效地抵消了可能由个体对物体的偏好所引起的任何无关影响。

在领结形迷宫的样本试验中，啮齿动物获得的时间相对较短（1分钟），这可能会对其记忆保持表现不佳产生影响。

文献引用：

1. Albasser, M. M., Chapman, R. J., Amin, E., Iordanova, M. D., Vann, S. D., & Aggleton, J. P. (2010). New behavioral protocols to extend our knowledge of rodent object recognition memory. Learning & Memory, 17(8), 407-419.

2.Albasser, M. M., Amin, E., Iordanova, M. D., Brown, M. W., Pearce, J. M., & Aggleton, J. P. (2011). Separate but interacting recognition memory systems for different senses: The role of the rat perirhinal cortex. Learning & Memory, 18(7), 435-443.