深度长文，拆解抗体的“可开发性”！

引言：今天搞个大的，啃一篇关于抗体开发中可开发性（developability）评估的 老文章 。

生物药从早期发现到上市，是耗时、耗力且风险高的工作。 在药物开发早期阶段选择并筛选这些特性，有助于节省资源，避免代价高昂的后期失败。

这篇文章介绍了在研发不同阶段，用于评估“可开发性”的多种体内（in vivo）、体外（in vitro）和计算机模拟（in silico）方法和技术。

药物临床的成功最终取决于抗体在人体中的安全和有效性，但实现这些终点所依赖的基础属性包括抗体的效力、特异性、免疫原性、药代动力学，及其在体内和储存过程中的生物物理特征。

随着双抗和ADC等更为复杂的生物药的问世，CMC及相关法规的依从性也成为商业成功的关键，因为生物药需在高质量标准下重复的、批量生产。

综合看，上述的这些性能指标常被统称为生物药物的“可开发性”。

01

抗体来源

抗体及其片段是目前生物药中最大的一类分子。

抗体常来自血浆、杂交瘤细胞或重组细胞系，或是天然（动物或人）或合成的序列。

抗体的来源和起源会影响其可开发性特征。

天然抗体，源于未经改造的天然序列，常从（免疫）动物或患者体内获得，是最常用的抗体来源。

因源自体内，经历过体内亲和力成熟和自我耐受过程，往往拥有较好的可开发性，但人源和动物源抗体依然存在显著差异。

人源抗体免疫原性低，而非人源抗体则根据来源动物的不同，可在患者体内引发较强免疫反应。

免疫原性风险可通过多种方式降低。如，抗体人源化，或用转人免疫球蛋白动物（如兔或小鼠）进行免疫。

通过免疫获得的抗体的一个潜在局限是：往往主要针对抗原中最具免疫原性表位，这限制表位多样性，并可能漏掉某些重要但低免疫原性或无免疫原性抗原表位结合分子的发现。

此外，若免疫策略不当，由于自身耐受机制， 与宿主高同源性靶点免疫后，可能无法获得特异抗体。

为避免上述局限，合成抗体出现了。

合成抗体源于人工设计的重组抗体库，借助体外展示技术进行高通量筛选， 这类抗体技术理论上可针对任何靶点进行筛选。

合成抗体技术，可去除某些已知对结合不利的氨基酸残基，调节可变区长度，设计出新抗体结构，甚至创造出自然界不存在的抗体库。

然而，合成抗体未经历体内亲和力成熟，未经天然进化，可能带来意料外的可开发性问题，如非特异性结合、免疫原性、易聚集、表达水平低等。

02

展示技术

过去几十年，大规模展示技术使人们能构建大规模、多样化抗体及蛋白和肽库，从中筛选出具有理想结合特性的候选序列。

然而，抗体的开发不仅局限于结合或亲和特性，其他因素同样影响候选抗体能否被开发为有效、可生产的、安全且稳定的药物。

这些因素包括，高浓度时的聚集倾向、非特异性结合，及抗体的药代动力学特性等，这些都可能导致开发过程中的失败。

如果仅专注于提高亲和力，可能会产生亲和力增强但生物物理特性变差的变体。

可开发性问题常在完成初步发现、亲和力优化和选择先导分子进入临床前被考虑。但如今，倾向于在发现阶段更早地评估生物物理特性，避免后期时间和资金损失。

所以，与其等到输出的几十或上百个克隆后再筛查生物物理特性，不如利用展示技术构建大规模变体库，直接筛选具备良好生物物理特性的抗体变体。

筛选技术以噬菌体展示（phage display）为代表，已被应用于筛选具备更高热稳定性的克隆。如，通过将文库暴露于高温下，筛选能与靶点结合（这需要正确折叠）的克隆。

也有研究将抗体文库置于酸性条件，筛选出兼具热稳定性和耐聚集未折叠状态的克隆。

其它的展示技术包括杆状病毒展示、核糖体展示、酵母展示和高等真核细胞（如哺乳动物细胞）展示系统。

其中哺乳动物细胞展示系统，较其他系统有一定优势。与分泌型表达系统比，这种系统表达的抗体保留在细胞表面，通过跨膜结构锚定，并在内质网或细胞表面达到局部高浓度。

在这种高浓度环境下，抗体聚集风险很大，生物物理特性不佳的克隆常在此浓度下聚集，这些聚集体会被细胞的质控机制识别并清除，因此，这些克隆在细胞表面的展示水平会很低。

通过哺乳动物展示系统检测生物物理特性的能力，使得可以从变体文库中筛选出具有更优可开发性特征的克隆。

多参数流式细胞术可实现同时筛选抗体的最佳生物物理特性，并保留其抗原结合能力，可在不影响靶点结合前提下，对参与靶点结合的互补决定区（para残基进行优化以提升生物物理特性。

该系统的强大能力在于，能够创造出比母体抗体具有更优生物物理特性和更低免疫原性的抗体变体。

03

生物物理表征

无论采用何种策略，抗体的发现都是从初期的几十到上千个候选分子，最终筛选出一个用于细胞株开发和生产。

最优候选分子，除功能属性外，生物物理特性表征也很重要，有助于在开发早期就淘汰可开发性差的抗体。

抗体药的一个关键特征是高度特异性，即对靶点高结合力和对非靶点的低结合力，这对于降低异常药代动力学和抗体快速清除风险至关重要。

为评估非特异性结合，常用方法是酶联免疫吸附试验（ELISA），通常涉及抗体与多种非靶标分子的结合，如单链DNA、双链DNA、脂多糖（LPS）、胰岛素以及钥孔虫血蓝蛋白（KLH）。

除特异性外，SMAC（单层直立色谱）检测还可以识别更易发生沉淀和聚集的抗体。非特异性结合也可能由表面疏水性引起，这通常通过疏水作用色谱（HIC）来量化检测。

抗体药的另一关键特性是高度胶体稳定性及较低的自聚集和自交联倾向，这一特性对皮下注射所需的高浓度制剂尤为重要。

已有多种检测抗体自我交联的分析方法，包括静态光散射和动态光散射。这些分析方法需要高浓度且高纯度的抗体，难以在早期药物开发阶段应用。其他替代方法，包括自我相互作用色谱（SIC）、交互作用色谱（CIC），及通过生物层干涉法（BLI）检测克隆自我交联。

抗体的第三个关键特性是其高度的折叠稳定性。

考虑到抗体要需要具备数年货架期，获取真实时间尺度下的稳定性数据极为耗时。为了加速稳定性分析，常采用各种应激条件。热稳定性一般通过差示扫描量热法（DSC）或差示扫描荧光法（DSF）进行测定。

除温度外，还可以利用表面介导的应激来评估抗体的稳定性。用表面应激分析法评估的聚集倾向，与其他生物物理性质评估方法（如温度诱导聚集和AC-SINS）结果高度相关。

综上所述，这些及其他体外分析方法，使药物开发者能够筛选出兼具多项优良可开发性特征的抗体。

然而，所有体外分析方法都要求抗体的浓度和纯度，需纯化和制剂，不利于高通量的筛选、无法降低成本与人工劳动强度。因此，对抗体蛋白需求不高的，in silico方法正日益受到关注。

04

大数据、机器学习及可开发评性估

通过in silicon评估可开发性尤其适用于生物治疗药物研发早期阶段，此时的实验数据极为有限，甚至没有。

最佳的计算评估介入时机是在获得免疫或展示实验得到抗体序列后，需从中筛选部分序列进一步实验。

这一阶段常用的筛选策略包括基于VH-VL种系配对及表位/互补决定区（paratope）多样性对抗体进行聚类。

一次免疫筛选往往能产生数千条潜在阳性序列。大部分抗体在后续验证实验中并不能结合靶标，或出现多种可开发性难题。

通过计算分析预先“标记”出问题抗体，有助于优先安排实验资源用于更有潜力的序列。

典型的可开发性评估包括化学降解相关基序的预测，如氧化、脱酰胺、天冬氨酸异构化，同时也要检测糖基化和非常规半胱氨酸残基的存在。

还可用序列分析方法预测抗体的“人源性”百分比、“天然性”、潜在易聚集区域和MHC II类分子结合的免疫表位。

借助适度计算资源，可以对数百甚至上千种抗体结构进行建模，这些结构模型可用于计算多种理化描述符特性如等电点pI、电荷、疏水分布失衡、VH-VL接口埋藏表面积以及分子表面斑块等。

抗体等电点（pI）会影响抗体的药代动力学、组织分布、与FcRn的结合能力、纯化、制剂（如稳定性和黏度）等多个方面。一般说，治疗性抗体的等电点通常在6到9之间。

通过将抗体的计算属性与临床或市场上已有抗体进行对比，可以对这些候选抗体的“类药性”进行评估。

根据具体药物研发项目的不同，先导分子可能还需进行亲和力成熟、人源化、分子结构改造，及进一步优化以适应开发平台。这也需要利用计算蛋白工程工具对先导分子进行优化。

在早期开发阶段，评估优化后的先导分子与开发平台的适配性。此时，计算可开发性评估应包括对全长抗体结构的建模，以更准确地描述所计算的属性。

这一阶段，采用多尺度分子模拟和机器学习模型有助于及早识别配方开发过程中的挑战，如聚集、扩散相互作用、黏度和溶解度，理化降解及免疫原性等问题。

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结构和分子动力学视角

抗体的结构与动态特征分析是对其理化性质（如化学修饰、抗原识别和受体结合）进行工程改造的前提。

蛋白质，尤其是抗体的三维结构，并非静止不变，而是处于动态变动中。这些构象变动发生在不同时间尺度上，从纳秒到秒级不等。

在阐明抗体功能和性质时，单一静态结构不足以反映其真实状态，即便是罕见的构象状态，也可具有重要意义！特别是当它们导致不可逆修饰或作为单向平衡的一部分时。

因此抗体的互补决定区（paratope）应是溶液中所有构象的集合。这些paratope集合体表现为CDR环协同运动、结构域间和肘部角度重排等特征。

将抗体视为溶液中的构象集合，不仅有助于结构预测，还能指导工程化流程、识别可开发性隐患并优化生物物理性质。

研究表明，抗体聚集可由低丰度构象促进。与疏水表面的相互作用会促使抗体向更疏水的构象转变，而这些构象更易发生聚集。同样地，升高温度也会促使构象集合向易聚集构象转变，在实验中表现为不可逆聚集。

另外，抗体的结合能力和生物物理性质均可能受电荷影响。然而，蛋白质中氨基酸的pKa预测依然极具挑战性。

因此，将抗体视为溶液中的构象集合，能提升结构预测的准确性，更好地评估其生物物理性质。

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可开发性的细胞水平分析

对患者免疫系统，治疗性生物大分子属外来分子，药物的分子结构特征和制剂引发的免疫原性可导致急性或长期问题。

如，固有免疫和适应性免疫激活、急性细胞因子风暴，或抗药抗体（ADA）的产生，进而中和药物并降低疗效。

ADA与生物药形成复合物可能对患者产生不良影响，这可能与固有免疫反应有关，导致抗原递呈、炎症因子分泌以及T/B细胞激活。

抗体免疫原性的一个驱动因素是T细胞激活及其导致的细胞因子释放。为此，可采用体外免疫细胞激活分析，将候选生物药和外周血单个核细胞（PBMC）孵育，检测激活性T细胞表位。

实践表明此类分析能够测试临床单克隆IgG抗体的免疫原性增加，如T细胞增殖和促炎细胞因子（如IL-2、IFN-γ）的释放，并已被EMA和FDA列为重要工具。

患者体内的真实免疫原性难以准确预测，主要因为药物递送方式、具体治疗背景及人体免疫应答的高度复杂性（包括个体HLA差异）等多种因素所致。

IgG抗体和基于白蛋白的生物药都具有良好的体内和跨屏障转运性能，在人体中的血浆半衰期平均可达三周。这一特性主要源于它们能与新生儿Fc受体（FcRn）结合。

FcRn主要存在于多种造血和非造血细胞的酸化内体中，并以pH依赖性方式结合配体：在微酸性pH下结合，在中性pH下释放。

通过这一过程实现配体的细胞内再循环或跨细胞转运，使FcRn受体能够“拯救”配体（如IgG或白蛋白）免受胞内降解，从而提高药物浓度和延长半衰期。

因此，测定生物药与FcRn的pH依赖性结合动力学就非常重要了，这常涉及如表面等离子体共振（SPR）、微尺度热泳和亲和色谱等技术，预测FcRn介导的转运效率。

针对FcRn介导的细胞再循环和跨细胞转运的细胞分析方法已经存在，并被用于揭示FcRn结合型分子被细胞摄取和分选的机制。如人内皮细胞再循环分析（HERA），该细胞过表达人源FcRn，可用于筛选FcRn靶向分子的摄取能力，及其从胞内富集和/或降解过程中的“转运”能力。

要充分发挥上述细胞分析方法的作用，需综合考虑生物药的生物物理特性。例如，Fc-融合分子的表面电荷会通过依赖或不依赖FcRn的方式影响其在细胞内的处理过程。

Briakinumab和Ustekinumab两种抗体都结合相同靶点IL12/23的p40亚基，但它们不同的表面电荷分布导致在人体内半衰期存在巨大差异。

具体说，Briakinumab的Fv结构的电荷特性影响其与FcRn的相互作用。细胞实验显示，这会导致Briakinumab发生FcRn非依赖地细胞内积聚，从而解释了其较短的半衰期。

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小鼠的临床前药代动力学评估

细胞分析可以指导生物药先导分子的筛选和设计，但候选药物在体内的行为还必须在可靠动物模型中进行评估。

非人灵长类动物在生物学上与人类非常接近，但由于成本高、获取难度大及伦理问题，在早期开发阶段的应用受到限制。

因此，更常用的是小型动物模型，如小鼠。

这类研究须精心设计，充分考虑小鼠与人类在配体结合和表达上的物种差异。如，抗-VEGF抗体贝伐珠单抗虽能有效阻断人血管内皮生长因子（VEGF），但无法阻断小鼠VEGF，这意味着小鼠无法用于该药开发。

此外，小鼠和人类FcRn对配体的结合存在很大不同：小鼠IgG与人FcRn结合非常弱，而人IgG与小鼠FcRn的结合反而强于与人FcRn的结合。

这些跨物种差异推动了人FcRn转基因且缺失小鼠FcRn的小鼠品系的发展。这类转基因小鼠模型中获得的数据与非人灵长类动物和临床观察数据高度相关，已成为人IgG类生物药药代动力学评估的金标准。

在人体内，注射用IgG和基于白蛋白的治疗药物会与大量内源性IgG和白蛋白竞争FcRn的结合位点，这两者在人体中的浓度分别约为12 mg/mL和40 mg/mL。

这种竞争会对FcRn的配体结合位点造成压力，从而影响注射IgG和白蛋白的血浆半衰期。

但由于实验动物设施要求无病原环境，小鼠体内的内源抗体水平很低，这可能会掩盖候选生物药的真实表现。因此，要准确预测药代动力学，这一因素必须考虑。可通过预先高浓度静脉注射免疫球蛋白（IVIg）来实现。

使用人FcRn转基因小鼠可避免上述问题。这些小鼠能持续分泌大量内源性白蛋白，从而为人白蛋白药物建立了一个有竞争性的环境。

更贴近生理环境的替代方法包括：使用同时表达人体FcRn但缺乏内源性白蛋白的小鼠，并用人白蛋白进行预先注射，类似于在研究IgG时引入IVIg或使用转基因小鼠，将小鼠白蛋白替换为人白蛋白。

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细胞系构建和生物药生产

多数生物药都是价格昂贵的治疗性制剂，直接用于患者体内，因此生产过程必须高效、安全且可重复。

哺乳动物细胞是市场上抗体类药物最常用的生产宿主，但生物药同样可以在细菌、酵母和无细胞表达系统中制备。

采用哺乳动物细胞培养通常涉及数十亿活细胞，要在大规模条件下控制和可靠复现其中复杂的生物学过程极具挑战。

理想的细胞系需具备高效表达目标产品，能稳定传代60代以上，具有高产率和一致的产品质量，并且整个过程高度可复制。

生产细胞系早期通过随机整合表达蛋白的基因，然后广泛筛选高表达克隆；如今则转向更为精准的方法，如靶向基因整合，以实现可重复的细胞生长和产量；插入更大遗传元件，以获得稳健且产量高的细胞系；及引入多种细胞工程策略，从而实现稳定一致的产品质量。

尽管高产且稳健的细胞系构建方法在过去几十年取得了显著进步，但生物药的高效生产仍面临持续挑战。其中一个原因是生物药分子日益复杂，复杂的异源蛋白可能带来额外的细胞应激甚至导致细胞死亡。

另一个挑战来自生物药表达系统的变化，常见于早期研发阶段与后续生产阶梯之间的变更。

早期常偏好瞬时人源表达系统，因为更易操作且能快速获得可用数量的产物，而商业化生产则更常采用CHO稳定细胞系。

这种表达系统的变化会导致产量和产品质量（如糖基化、聚集、蛋白折叠）出现显著差异，因此，在切换至新的表达系统进行商业化生产前，产品需进行全面再表征。

在细胞系开发过程中，常会遇到如低产量、产品质量变化等问题，进而影响药物的疗效、质量和患者安全性。

药物开发过程中，越早考虑细胞系开发因素，生产成功的概率就越高。

引入包含早期产品评估与稳定细胞系构建的一体化平台，也能提升生产成功率。如，采用靶向整合平台实现可预测的高产量，使得从分子发现到商业化生产都能在同一细胞系内完成，从而极大降低批间差异并提升效率。

进一步的灵活性可通过构建多种糖工程细胞系文库来实现，便于研究和选择决定生物药稳定性、血浆半衰期和免疫原性的最优糖基化型，最终可直接将拥有理想糖基化特征的细胞系用于大规模生产。

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结论与展望

生物药的发现与开发从最初主要关注高亲和力和靶标特异性、精确结合位点以及实现特定功能，逐步扩展到可开发性（developability）等因素的考量。

这种更全面、注重多维度工程设计的思路，有望带来更优秀的药物候选分子，同时减少药物开发后期失败的风险。

然而，许多情况下，尤其是对全新类型的生物药来说，什么是良好的可开发性特征并不十分明确。

在该领域，预计体外计算预测（in silico prediction）将在药物发现早期扮演愈加重要的角色，因为一旦模型建立，就可提供高通量、低成本的分析结果。

除体外计算方法外，生物物理实验手段仍将在评估可开发性方面发挥作用。自动化、微型化和数字化是药物研发的核心趋势。配合创新体外功能测定方法，这些手段有望实现新生物药在早期筛选和表征阶段更高效、更智能的决策。

此外，有助于生物药开发的另一个方向是构建和应用更能反映临床环境及人类药物表现的动物模型。