《Mater. Today Bio》第三军医大学董世武等人：水凝胶治疗骨质疏松

骨质疏松症（OP）是一种临床常见的骨骼疾病，其破骨细胞（OCs）过度活化会显著延缓骨再生进程。在此背景下，骨再生不仅需要促进成骨与抑制骨吸收，还对血管化（尤其是H型血管）提出了更严格的要求。近年来，锶（Sr）作为"双效骨剂"既能促进骨形成又可抑制骨吸收，却仍未获得足够重视。鉴于破骨前体细胞（pOCs）分泌的PDGF-BB能在成骨耦合过程中诱导H型血管形成，Sr2+对破骨细胞生成的调控作用亟需在血管化骨再生领域深入研究与应用。

来自中国人民解放军第三军医大学的董世武等团队通过用Sr2+部分取代层状双氢氧化物（LDH）中的二价金属离子，合成了锶取代LDH（Sr-LDH），并将表面修饰的Sr-LDH封装至含有QK肽的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）中，形成复合水凝胶GelMA-QK/Sr-LDH@PDA（GLQ）。这种多功能水凝胶整合了Sr-LDH的促成骨与抗吸收特性，在骨质疏松条件下展现出显著的骨再生功效。进一步研究发现，GLQ能刺激骨髓源性巨噬细胞（BMMs）增殖并维持pOCs群体，同时抑制OC成熟分化，从而促进PDGF-BB表达并推动骨缺损区H型血管发育。该多功能复合水凝胶为未来骨质疏松性骨缺损治疗提供了重要临床转化价值。相关工作以题为“Strontium-loaded multifunctional gelatin methacryloyl hydrogels for type-H vascularized bone regeneration under osteoporotic conditions”的文章发表在2025年05月29日的期刊《Materials Today Bio》。

【材料的合成与表征】

LDH与Sr-LDH的SEM和TEM结果如图1A、B所示，二者均呈现纳米层状结构。值得注意的是，Sr的引入并未阻碍LDH纳米层状结构的形成。通过PDA氧化自聚合对Sr-LDH进行表面修饰后，获得的Sr-LDH@PDA经TEM观察显示，PDA修饰未改变Sr-LDH的晶体结构。DLS分析表明，PDA表面修饰虽使Sr-LDH纳米片的尺寸略有增加，但显著提升了其分散性。这一改进对实现水凝胶基质中的均匀分散至关重要，从而为Sr²⁺的长期缓释奠定了理想基础。本文通过EDS与ICP对LDH及Sr-LDH的元素组成进行定性与定量分析。如图1C、D所示，EDS结果证实Sr成功掺入LDH结构并均匀分布，形成Sr-LDH。基于LDH化学组成的可调控性，本研究采用共沉淀法将Sr²⁺引入LDH，因其与Mg²⁺价态相同，故部分取代Mg²⁺制备出Sr-LDH。ICP定量分析显示，Sr²⁺部分取代Mg²⁺后，Sr-LDH中Mg:Sr比例约为6:1。

不同GelMA水凝胶的SEM图像如图1E所示。结果表明，本研究制备的GelMA水凝胶具有大孔径多孔结构，有利于细胞黏附与生长。这种大孔结构模拟了体内微环境，使细胞能在三维环境中生长，同时促进营养物质/调控因子的运输、代谢产物的排泄及细胞间通讯。需特别指出的是，学界普遍认为多孔水凝胶能促进血管化及新生骨组织形成。

图1 材料的形貌与组分表征

图2A展示了水凝胶样品的典型照片，所有圆柱状水凝胶直径约5毫米、高度约2毫米。本文系统评估了不同GelMA水凝胶的体外降解行为（4周周期）、Sr²⁺释放曲线及QK肽释放动力学（图2B、C）。如图2B降解曲线所示，通过AC-PEG-NHS偶联QK肽的水凝胶较未修饰组降解更缓慢，28天后仍保留约91%初始质量；而直接掺杂Sr-LDH@PDA纳米片的水凝胶降解最快，这可能是由于无机纳米材料的引入破坏了水凝胶网络结构所致。对于复合水凝胶GLQ，尽管含有Sr-LDH@PDA纳米片，但因存在AC-PEG-NHS连接的QK肽，28天后仍保留约76%初始质量，表明GLQ能维持长期稳定性，有利于骨组织再生的持续缓慢进程。

图2C(a)显示GLQ复合水凝胶可实现Sr²⁺的持续缓释。累积释放曲线表明，GLQ组的Sr²⁺释放显著慢于GL组，这归因于QK肽通过AC-PEG-NHS交联至GelMA网络，强化了水凝胶结构从而延缓降解。值得注意的是，GL与GLQ组在第10天时均呈现近平台期释放特征（累计释放约20%），这种与降解进程同步的释放模式能满足骨质疏松条件下骨修复的长期治疗需求。图2C(b)中QK肽释放曲线显示，相较于直接混合QK肽的G/Q组，通过AC-PEG-NHS偶联的GLQ组释放更缓慢。虽然Sr-LDH@PDA纳米片的加入部分破坏了水凝胶网络导致QK释放相对加速，但仍慢于G/Q组。这种纳米片介导的加速释放可能源于双重机制：化学作用（纳米颗粒与GelMA基质的静电/氢键/共价交联破坏网络稳定性）与物理作用（纳米颗粒提升孔隙率并重组微观结构，促进水分渗透和降解动力学）协同导致水凝胶解体。此外，GQ与GLQ组在第10天趋于平台期，而G/Q组仍呈加速释放趋势，进一步证实AC-PEG-NHS作为连接分子对QK肽缓释的关键作用。该双功能PEG交联剂中，丙烯酸酯参与光固化GelMA水凝胶形成，NHS则与QK肽的氨基形成稳定酰胺键，将QK肽锚定于强化网络中延长释放周期。综上，Sr²⁺与QK肽的双重缓释可延长体内有效浓度时间，减少代谢损耗，提高生物利用度并降低副作用。

图2 GelMA水凝胶的理化性能、力学性能及生物相容性

【复合水凝胶GelMA-QK/Sr-LDH@PDA在体外实验中显示出抑制骨吸收、增加前破骨细胞(pOC)数量并促进PDGF-BB释放的作用】

经过五天破骨细胞诱导培养后，骨髓单核巨噬细胞(BMMs)的TRAP染色及定量分析结果如图3(A、E、F)所示。TRAP染色显示，常规诱导的C组和G组BMMs成功分化融合形成多核成熟破骨细胞(OCs)，细胞面积大且边界清晰；而GL组与GLQ组的破骨细胞融合进程显著受抑，表现为大体积TRAP阳性细胞数量较C组明显减少，且未出现融合的大型成熟OCs(图3A)。TRAP阳性区域定量分析(图3E)证实GL组与GLQ组数值显著低于C组。值得注意的是，对TRAP染色图像中单核pOC的计数结果显示(图3F)，GL组与GLQ组的pOC数量不仅未被抑制，反而显著高于G组与C组，这表明Sr-LDH具有增加pOC数量的作用，与本研究团队前期图2E中发现的含锶组GL/GLQ促进BMM增殖的结果一致。

本文通过骨吸收实验进一步评估破骨细胞的骨吸收能力：将BMMs接种于牛骨切片与胶原板上进行7天破骨诱导培养。甲苯胺蓝染色结果显示(图3B)，常规诱导的C组与G组骨切片表面出现多个甲苯胺蓝阳性区域，并伴有明显穿孔结构，这些光学显微镜下的半透明区域是骨吸收的直接证据；而GL组与GLQ组不仅阳性区域显著减少，且未见穿孔痕迹，表明其破骨细胞骨吸收能力受到显著抑制。此外，胶原板骨吸收实验结果更直观显示GL组与GLQ组的骨吸收能力被显著遏制(图3C)，相应吸收区域的定量分析结果(图3G)与上述发现趋势一致。

图3 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝胶在体外抑制破骨细胞生成并促进PDGF-BB释放

【GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝胶在体外显著促进成骨作用】

对骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行7天成骨诱导后，ALP染色及定量分析结果如图4A、D所示。ALP染色图像显示，相较于C组与G组，GL组与GLQ组呈现更广泛的ALP阳性区域且染色更深。ALP阳性区域的定量分析结果与此一致，证实GL组与GLQ组能显著促进成骨细胞(OBs)中ALP的表达。经28天成骨诱导后，BMSCs的茜素红S染色及定量分析结果如图4B、E所示。代表性染色图像显示，与C组和G组相比，GL组与GLQ组具有更多茜素红S阳性区域且矿化结节染色更深，定量数据进一步验证了这两个组别显著增强了OBs中钙化结节的形成。

为深入探究不同组别水凝胶上清液对BMSCs成骨分化的影响，在7天成骨诱导后提取细胞RNA并进行qRT-PCR分析(图4G-K)。结果表明复合水凝胶GelMA-QK/Sr-LDH@PDA能显著提升成骨相关标志基因(ALP、Runx2、Osterix、Col1、OPN)的表达水平。其中Osterix作为成骨细胞分化的关键转录因子，GL组较G组表达量显著升高，证实Sr-LDH具有促进成骨作用；Runx2则是调控成骨细胞分化发育的重要转录因子，可促进骨形成、矿化及骨健康维持中不可或缺的OPN与Col1基因的转录翻译。

图4 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝胶在体外促进成骨分化

【GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝胶显著增强体外血管化能力】

通过管形成实验评估bEnd.3细胞在不同GelMA水凝胶（G组、GL组和GLQ组）上的血管形成能力，以Matrigel组作为阳性对照（图5A）。结果显示，在GelMA系列水凝胶中，GLQ组最能有效促进bEnd.3细胞形成管状结构，其环形结构数量、分支点数量及管腔直径均接近Matrigel组水平（图5C-E）。细胞迁移实验表明（图5B、F），所有GelMA水凝胶组（G、GL、GLQ）均显著促进细胞迁移，其中GLQ组增强效果最为突出。G、GL、GLQ三组迁移率依次递增，证实Sr-LDH与QK肽均有利于内皮细胞迁移。经7天诱导培养后，qRT-PCR检测显示（图5G、H），GLQ组的CD31和vWF基因相对表达量显著高于其他组。vWF蛋白水平反映内皮细胞活化状态，而CD31（即血小板内皮细胞黏附分子-1）对外周血管连接/完整性调控具有重要作用。该结果证实GelMA-QK/Sr-LDH@PDA复合水凝胶较其他组更能促进血管化，此效应主要归功于QK肽的作用，与既往研究结论一致。G组与GL组的CD31、Emcn相对表达量无显著差异，且均显著低于GLQ组，表明复合水凝胶中的Sr-LDH对血管化无显著促进作用，进一步印证了VEGF模拟肽QK在增强血管化方面的卓越效能。

图5 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝胶在体外增强血管

【GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝胶显著促进骨质疏松性骨缺损模型的体内骨再生】

通过Micro-CT扫描与三维重建进行骨再生可视化及定量分析（图6A），术后8周取材显示：与假手术组（Sham）相比，卵巢切除组（OVX）的骨密度（BMD）和骨体积分数（BV/TV）显著降低（图6C、D）。Goldner三色染色结果（图6B）证实OVX组骨小梁明显稀疏，结合Micro-CT结果成功建立雌激素缺乏型骨质疏松大鼠模型，为后续水凝胶治疗效果评估提供临床前研究平台。骨缺损造模并植入材料8周后，Micro-CT分析显示（图6E-G）：与空白对照组（C组）相比，GLQ组的BMD和BV/TV值显著提升，表明该复合水凝胶具有最优的骨修复效能。

图6 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝胶促进骨质疏松性骨缺损的再生修复

Goldner染色结果（图7A）进一步证实，GLQ组缺损区实现完全闭合且与原始皮质骨无缝整合（红色虚线框标示），同时各组均可见水凝胶残留，说明GelMA水凝胶的缓释降解特性与骨再生进程良好匹配。破骨细胞TRAP免疫组化染色显示（图7B），GLQ组骨再生区周围存在多核破骨细胞聚集的TRAP阳性区域（图7C）。结合同区域Goldner染色结果，这些TRAP阳性区域恰好分布于未矿化的新生骨周围，提示在骨再生早期阶段破骨细胞尚未启动骨吸收功能。值得注意的是，术后8周组织学观察显示新生骨仍处于早期矿化阶段，远未进入破骨细胞介导的骨改建期——该阶段通常发生于修复期后期，涉及骨痂重塑与骨小梁结构优化。CD31免疫组化评估显示（图7D），GLQ组缺损区CD31阳性细胞数量最多，骨再生区域可见多个由CD31阳性细胞构成的完整血管环状结构，环内存在类血小板细胞，证实该组血管化程度显著优于其他各组。

图7 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA在骨缺损区域增加TRAP+与CD31+细胞，并伴随更好的骨再生效果

GelMA-QK/Sr-LDH@PDA通过抑制破骨细胞成熟并保留前体破骨细胞（pOCs），促进PDGF-BB的释放，从而增强H型内皮血管化。图8A与C-D显示的TRAP与PDGF-BB免疫荧光及分析表明，GLQ组使骨再生区TRAP+/PDGF-BB+细胞数量增加。结合图7C-D组织学结果可见，骨再生区PDGF-BB高表达，根据Goldner三色染色与CD31染色结果，这些TRAP阳性区域附近还可见增强的新骨形成与血管化。值得注意的是，不同于骨再生良好区域破骨细胞数量通常减少的共识，本研究发现骨再生区TRAP表达升高伴随更多破骨细胞，这促进了PDGF-BB表达进而加速骨再生。该结果与图2E、图3(F,H,I)的细胞分子实验结果一致：含Sr2+的GL与GLQ在破骨细胞生成早期促进其增殖，并通过维持pOCs同时抑制成熟破骨细胞（OC）来增强PDGF-BB表达（ELISA与qRT-PCR结果证实）。

学界公认血管化在骨再生中起关键作用，其中H型血管作为特殊亚型对骨形成具有显著调控作用，与骨量维持及稳态密切相关。图8B、E-F的CD31/Emcn共染免疫荧光显示，相较于对照组，所有GelMA水凝胶组的骨再生区荧光强度显著增加，其中GLQ组平均荧光强度最高，表明复合水凝胶GLQ能促进H型血管形成。综合共染结果与前期组织学评估可知，GLQ通过上述机制增加PDGF-BB释放，展现出促进骨质疏松性骨再生的潜力。此外，图8A中GLQ组合并图像显示再生区内残留水凝胶边缘与新生骨组织相互嵌合，水凝胶表面可见细胞浸润迹象，其降解速率与骨再生进程动态匹配，表明该材料是具有临床转化潜力的骨修复生物材料。

图8 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA促进PDGF-BB释放并增强H型内皮血管化

【总结与展望】

骨质疏松症一直是全球性重大健康问题。尽管临床上广泛使用各类破骨细胞抑制剂和促骨形成药物以重建失衡的骨代谢平衡，但这些治疗手段在修复骨质疏松性骨缺损时仍难以实现充分的血管化和理想的骨再生效果。本研究设计了一种多功能复合水凝胶GelMA-QK/Sr-LDH@PDA，以甲基丙烯酰化明胶（GelMA）为载体，整合了锶负载纳米颗粒（Sr-LDH）。该复合生物材料系统统筹考虑了Sr-LDH的双重调控作用，结合QK肽的干细胞招募功能与VEGF拟态活性，在促进成骨与血管化的同时，还能对破骨细胞生成过程进行精准调控——通过抑制破骨细胞成熟并促进保留的前体破骨细胞（pOCs）释放PDGF-BB，进而驱动H型血管形成，最终在骨质疏松条件下实现骨再生增强。这一策略为未来骨质疏松性骨缺损的治疗提供了重要临床转化思路。此外，本研究采用的材料设计策略（如通过层状双氢氧化物可调控的化学组成负载生物活性离子以靶向调节生理/病理过程，或将功能性多肽与水凝胶系统整合以启动并维持特定生物响应）也为其他疾病领域的生物医用材料开发提供了有价值的参考范式。

参考资料：

https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2025.101909

来源：EngineeringForLife