Kirkstall Quasi Vivo 构建血管化的三维SC-islet类器官模型

1. 细胞准备

- 人多能干细胞（hESCs）分化为SC-islets：

- 使用H1 hESCs，按照七步分化步骤进行分化。

- 在第21天，将细胞用Accutase消化，重新聚集在低附着6孔板中，浓度为3×10⁶细胞/孔。

- 在第22天，将细胞聚集物转移到新的低附着6孔板中，并在118 rpm下振荡培养。

- 继续培养至第39天，用于后续的共培养实验。

- 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）：

- 购自Lonza，使用EGM-2培养基培养。

- 在第2代时，用表达Azurite Blue的慢病毒转导ECs，用于血管网络可视化。

- 人肺成纤维细胞（NHLFs）：购自Lonza，使用FGM-2培养基培养。

2. SC-islets的重聚集

- 将SC-islets用Accutase消化成单细胞，然后以约1000个细胞/微孔的密度接种到BSA包被的微孔平台（StemFIT 3D）中。

- 允许细胞在微孔中重新聚集至少2天，形成直径小于200微米的SC-islet簇。

3. 3D血管化SC-islet类器官的组装

- 制备3D纤维蛋白凝胶：

- 将纤维蛋白原粉末溶解在EBM培养基中，浓度为2 mg/ml。

- 将100个重聚集的SC-islets和2×10⁵个分离的ECs和FBs（1:1比例）悬浮在100 µl纤维蛋白原溶液中。

- 将细胞混合物与16 µl的50 U/ml凝血酶混合，形成凝胶。

- 凝胶培养：

- 将混合物倒入24孔板中，形成圆形凝胶滴。

- 在37℃下聚合30分钟。

- 在凝胶上添加不同的共培养培养基（见表S1），维持4-7天。

4. 共培养条件优化

- 培养基调整：

- 测试了不同比例的血管化培养基（VM）和SC-islet培养基（IM）对细胞存活的影响。

- 确定75% VM + 25% IM的混合培养基能够支持血管网络的形成，但会降低SC-β细胞的胰岛素含量。

- 采用逐步培养基变化（GM1）：从75% VM + 25% IM逐渐过渡到100% IM，以维持胰岛素含量。

- 细胞共培养：

- 在3D纤维蛋白凝胶中，将SC-islets与ECs和FBs共培养。

- 在GM1条件下培养5天，观察到ECs和FBs能够形成完整的血管网络，且SC-islets保持胰岛素含量。

5. 微流控设备中的血管化SC-islet类器官

- 设备制备：（略）

- 小编推荐使用成熟商品化的Kirkstall Quasi Vivo多细胞共培养微流控设备，通道通过组织室连接。

- 细胞加载：

- 将纤维蛋白原溶液（5 mg/ml）与0.15 U/ml抑肽酶和0.2 mg/ml纤维连接蛋白混合。

- 将100-130个SC-islets、35×10³个ECs和FBs（1:1比例）悬浮在5 µl纤维蛋白原-纤维连接蛋白溶液中，与1.2 µl的50 U/ml凝血酶混合后，加载到组织室中。

- 在37℃下孵育10分钟，然后用纤维连接蛋白涂覆上下通道，再孵育15分钟。

- 血管形成与培养：

- 在组织室中添加培养基，通过交替改变四个储液池中的培养基体积，诱导血管形成和与通道的吻合。

- 在第5天，使用70 kDa荧光素-葡聚糖测试血管的通透性。

- 在微流控设备中维持共培养长达7天，使用表S2中的培养条件。

6. 功能验证

- Ca²⁺成像：

- 使用GCaMP6f-hESCs生成的SC-islets，通过活细胞染色和免疫荧光染色，监测SC-β细胞的Ca²⁺信号。

- 在低葡萄糖（2.8 mM）、高葡萄糖（16.8 mM）和Exendin-4（10 nM）刺激下，记录Ca²⁺信号。

- 胰岛素分泌检测：

- 使用Biorep灌流系统进行动态胰岛素分泌检测。

- 测量不同刺激条件下的C肽含量，评估胰岛素分泌功能。

7. 单细胞RNA测序分析

- 对SC-islets和微流控设备中的ECs和FBs进行单细胞RNA测序。

- 使用CellChat分析细胞间通信网络，预测ECs和SC-β细胞之间的信号通路，如BMP4信号。

通过以上步骤， Maike Sander et al.成功构建了血管化的三维SC-islet类器官模型，并验证了其在模拟胰岛功能和疾病模型中的潜力。

附：微流控设备中血管形成的具体操作步骤如下：

（1）. 微流控芯片的设计与制备（略）

- 小编推荐使用成熟商品化的Kirkstall Quasi Vivo 动态3D活细胞自动化微流控设备

（2）. 基质胶的制备与灌注

- 基质胶预处理：将基质胶预聚液放置于4°C冰上过夜，使其充分融化。同时将移液器、吸头和微流控芯片提前预冷。

- 灌注基质胶：将融化的基质胶与无血清DMEM培养基按1:1比例混合，用预冷的移液器吸取10μL混合液，从微流控芯片中间通道的入口处轻轻注入。

- 凝胶形成：将灌注好的微流控芯片放置于37°C培养箱中孵育30分钟，使基质胶充分聚合形成凝胶。

（3）. 细胞接种与培养

- 细胞悬液制备：制备高密度的脐静脉内皮细胞（HUVECs）悬液，浓度为10⁶个/mL，与基质胶预聚液按1:1（v/v）混匀。

- 细胞接种：将HUVEC-Matrigel混合悬液注入微流控芯片的中间通道，置于37°C孵箱中孵育30分钟，形成包埋有细胞的基质胶网络。

- 培养基添加：在两侧通道中加入含有促血管生长因子（如VEGF、bFGF和EGF各10ng/mL）的DMEM完全培养基，为细胞生长提供营养。

（4）. 血管生成与观察

- 细胞活性检测：培养3天后，使用钙黄绿素和碘化丙啶进行双染，考察细胞活性状态。

- 细胞迁移与管样结构形成：在促血管生长因子浓度梯度的诱导下，观察内皮细胞的迁移和管样结构形成情况。每隔12小时换液一次，维持浓度梯度。

- 成像与分析：利用相差显微镜或荧光显微镜观察细胞的迁移和管样结构形成情况，使用ImageJ软件计算细胞的最长迁移距离和迁移面积。

（5）. 内皮细胞内衬与管腔形成

- 内皮细胞内衬：在微流控通道中，用层粘连蛋白包被通道，随后将高浓度的内皮细胞通入，使细胞均匀粘附在管腔壁上。

- 管腔形成：在细胞培养液层流剪切应力的作用下，24小时后，内皮细胞增殖并形成单层，构建模拟静动脉的大血管的内皮细胞内衬的管腔。

通过上述步骤，可以在微流控设备中成功构建血管网络，用于模拟体内血管生成过程和相关研究。

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