瞬态吸收光谱助力荧光自报告型光笼分子NPCD565用于光免疫治疗

　　图1. NPCD565光解机理。

　　2024年，华东理工大学杨有军教授、华东师范大学罗潇研究员、钱旭红院士和陈缙泉教授、上海中医药大学葛广波教授以及上海交通大学医学院附属第九人民医院闵沛如医生合作，在肿瘤光免疫治疗策略的开发上取得重要进展。研究团队提出了一种新的生物氧化还原调控策略——生成后自由基强化(post-generation radical reinforcement)。这种策略的核心在于先生成非氧化性自由基，如过氧亚硝酸盐(ONOO-)，随后通过某种机制将其激活成强大的氧化性自由基(亚硝酰过氧碳酸盐，ONOOCO2-)，以诱导ICD。通过这一策略，可实现更加精准可控的ROS释放，减少对正常组织的损伤。针对这一策略，研究团队开发了一种荧光自报告型光笼分子NPCD565，是首个可以释放ONOOCO2-的供体分子。

　　1.引言

　　光免疫疗法是一种很有前途的癌症治疗方式。免疫原性细胞死亡(Immunogenic Cell Death，ICD)激活宿主免疫系统，从而引发对肿瘤生长的长期抑制。由于其在癌症治疗中的突出潜力，ICD诱导剂的开发吸引了广泛而深入的研究关注。化疗、紫外线(UV)和伽马射线已知可诱导ICD。它们可能具有共同的ICD诱导机制，即通过产生强效的1-e氧化物种。这一假设激发了替代自由基产生纳米材料或光敏剂作为ICD诱导剂的设计。具有极高氧化电位的物种，如单线态氧(1O2)、羟基自由基(•OH)或硫酸根(SO4•-)通常被用于ICD。虽然已知强效氧化物种会诱导免疫原性细胞死亡，但它们也与非特异性氧化和附带组织损伤有关。后生成自由基强化策略能够应对这一挑战。该策略的本质是首先产生非氧化性或轻度氧化性自由基，然后将其活化为氧化能力显著增强的自由基，用于癌症的治疗。

　　过氧亚硝酸盐(ONOO-)对二氧化碳(CO2)的亲核攻击产生的ONOOCO2-符合标准。首先，它的产生需要一氧化氮(NO)和超氧阴离子(O2•-)，两者都是还原自由基。NO的生物学命运是产生一个电子，最终变成亚硝酸盐(NO2-)。O2•-是一种强大的还原剂，直到其负电荷被亲电子基团捕获。其次，它很容易同质化为二氧化氮(NO2)和碳酸根阴离子(CO3•-)的自由基混合物。NO2和CO3•-都是强氧化性的，已知通过蛋白质的翻译修饰后深度参与氧化还原信号传导。第三，生成的NO2和CO3•-的氧化还原电位分别为0.99和1.78 V，均显著低于•OH的2.30 V。如果证明具有免疫原性，与•OH相比，ONOOCO2-将是免疫治疗的更好替代品。

　　在这里，团队探究了一种ONOOCO2-的光触发分子供体(NPCD565)。它在从紫外线到红光的宽光谱范围的光照射下很容易分解。

　　2. NPCD565的光化学性质

　　图2. NPCD565光解和产物鉴定的光谱研究。

　　当NPCD565被从紫外到红光的宽光谱范围内的光照射时，ONOOCO2-与明亮的罗丹明染料(RD565)一起释放出来，其荧光是ONOOCO2-产生的定位、动力学和剂量的可靠和方便的内置报告物，为光免疫疗法的精准实施提供了有力工具。

　　3. NPCD565的体外光解和氧化物种的释放

　　图3. NPCD565的体外光活化。

　　图4. ONOOCO2-的体外免疫原性。

　　在三阴性乳腺癌4T1细胞中光解NPCD565后产生ONOOCO2-，观察到垂死肿瘤释放出的指示ICD的损伤相关分子模式(DAMPs)。这些DAMPs能够促使树突状细胞成熟，激活机体的免疫反应，从而进一步增强对癌细胞的攻击。对双侧荷瘤小鼠模型的体内研究表明，NPCD565对原发性肿瘤具有强大的肿瘤杀伤能力，对远处肿瘤具有生长抑制作用。揭示了ONOOCO2-的强大免疫原性，其供体(NPCD565)在癌症的光免疫治疗中具有广泛的潜力。

　　4. 瞬态吸收光谱研究NPCD565的光解机理

　　NPCD565有两个光敏位点，亚硝胺基的N-N键和罗丹明支架与COOH之间的C-C键。在光触发C-COO-键断裂时，CO2•-与相应的叔烯丙基自由基一起释放出来(图1的8)。CO2•-与O2自由基结合生成CO4•-可能接近扩散控制。然后，预计会发生8的苯基自由基断裂，通过中间体9的质子化进一步释放NO和罗丹明染料RD565。该步骤的动力学过程对于NO的及时释放和ONOOCO2-的有效产生至关重要。

　　团队采用瞬态吸收光谱(Helios)对这一过程进行了深入研究(图5)。在用365 nm激发NPCD565的溶液时，不可避免包含少量的RD565的基态漂白(GSB)信号，以及约450 nm处的激发态吸收(ESA)带。指示8存在的光谱特征是ESA峰在前几ps内从430 nm红移到450 nm(图5)。在此期间，545 nm处的漂白信号增强(图5)。这表明产生了一种在545 nm处吸收的新物种，显然是RD565。8的自由基裂解是一个超快反应，寿命为0.14 ps(图5)。因此，NPCD565光解生成ONOOCO2-是一个快速有效的过程。

　　图5. NPCD565在MeCN中的瞬态吸收光谱数据、拟合和动力学曲线。

　　5. 结论

　　这项研究不仅揭示了ONOOCO2-的强大免疫原性，还展示了其供体NPCD565在光免疫疗法中的广阔潜力，为临床肿瘤免疫治疗提供了新的药物候选.本工作使用的Ultrafast Systems瞬态吸收光谱仪展现出卓越的时间分辨能力，其仪器响应函数约120 fs，同时其光谱探测范围覆盖紫外波段至近红外波段。通过飞秒瞬态吸收光谱技术的应用，团队成功捕捉到了分子光产物的生成过程，这一关键发现为分子后续治疗应用提供了坚实的理论基础。