《食品科学》：北京工商大学李秀婷教授等：酱香型高温大曲制作过程中微生物群落演替规律与风味物质变化

传统酱香型白酒的酿造工艺复杂，历时一年的生产过程需历经2 次投料、9 次蒸煮、8 次发酵及7 次蒸馏取酒，而每个轮次发酵过程均需将糟醅摊凉并拌入不可或缺的糖化发酵剂——高温大曲，曲料比例高达1∶1，因此，高温大曲对于酱香型白酒独特的酱香风格特征的形成至关重要。

曲乃酒之骨。作为酱香型白酒生产过程重要糖化剂和发酵剂的高温大曲，由小麦等谷物经制坯、发酵、贮存等工艺过程制备而成。许多研究证实，酱香型白酒主体酱香风味与高温大曲的生物学特性间关系十分密切。

传统高温大曲的制造过程主要包括成型、发酵、成熟3 个过程。一般地，在高温大曲制备工艺过程中，温度的变化以及酸度、醇、微生物代谢产物等的增减均会改变曲块微生物发酵的环境条件，进而构建形成独特的微生物群落结构及丰富的酶系统，影响基酒的风味品质。与白酒酿造过程中的翻堆类似，大曲制备过程的两次翻仓操作必然会显著改变曲房内曲块的温湿度等发酵参数，进而影响曲块内微生物群落演替和代谢活动。

北京工商大学食品与健康学院的丁泽、陈曦、李秀婷*等采用高通量测序结合气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术对酱香型高温大曲制备过程中翻仓操作前后的微生物群落结构组成以及挥发性风味物质等进行探究，进一步分析翻仓操作前后微生物群落结构与挥发性成分之间的相关性变化，揭示大曲制备过程中微生物群落组成以及演替规律，阐释大曲内微生物群落的潜在功能并解析酿造白酒重要风味物质的形成根源，以期为实际生产提供基础数据与理论指导。

1 翻仓操作前后大曲微生物群落多样性分析

1.1 测序有效性分析

为探索翻仓操作对于大曲制造过程中曲块内微生物群落结构的影响，采用高通量测序技术分析E1、E7、E14、E46大曲样品中的微生物组成。为便于分析，在除去低质量序列、嵌合序列和PCR引物后，将序列相似性在97%以上的水平归为同一分类操作单元（OTU），最终获得具有117 个细菌OTU和316 个真菌OTU的有效序列。Shannon指数稀释曲线逐渐趋于平稳，表明测序深度足以满足后续分析，并且从足够的数据量中捕获了大部分系统型（图1）。

1.2

表1列出了微生物群落的α多样性指数，包括物种丰富度（Chao1和ACE）、多样性（Shannon和Simpson）和覆盖率。所有样本的覆盖率均为99.9%，表明本实验的测序结果可以较为真实地反映各样品中的细菌和真菌等微生物的多样性，测序结果的有效性较高。在发酵的前7 d，曲块内真菌群落的Shannon和Chao1指数显著降低，而细菌群落的Chao1指数也显著降低，Shannon指数同样表现出降下降趋势。发酵7～14 d，真菌群落的Chao1指数有些许提高，但Shannon指数继续降低；细菌群落的Shannon和Chao1指数则有所提高。发酵14～46 d，大曲曲块真菌群落的Shannon指数和Chao1指数再次升高，细菌群落Shannon指数降低，Chao1指数提高。此分析结果表明，处于发酵阶段的大曲随着曲块温度的升高曲块内微生物多样性降低；在两次翻仓操作期间，细菌群落的Shannon指数保持相对稳定，而真菌群落的Shannon指数显著降低，表明大曲发酵过程中曲块内真菌的多样性受发酵环境的影响更为剧烈。

1.3

基于OTU水平Bray Curtis距离的主坐标对各样品微生物群落结构相似度进行评价以评估β多样性，由图2可知，真菌和细菌群落结构两主坐标差异解释度累计方差贡献率分别为63.85%和80.59%（＞50%），能够可靠反映样品中绝大部分信息。β多样性分析显示，在翻仓操作前后的曲块样品中的微生物群落具有明显的聚类。翻仓操作前后的大曲在PCo1轴上相隔距离较远，说明微生物群落结构主要受PCo1影响，大曲制造过程中翻仓操作前后的菌群组成差异显著。

2 翻仓操作前后大曲微生物群落组成分析

基于翻仓操作前后的样品绘制了Venn图以判断是否存在仅在部分样本中特有或共享的OTU。如图3所示，样品中共检测到细菌OTU 117 个，其中E1、E7、E14、E46的样品中检出细菌OTU数量分别为96、38、67、78 个。同时，样品中共检出真菌OTU 316 个，E1、E7、E14、E46的样品中检出细菌OTU数量分别为222、31、46、221 个。E1和E46的样品中的真菌和细菌OTU数量远高于其他大曲样品，第一次翻仓的样品最低。结果表明，在这4 个样本中有32 个共有的细菌OTU和19 个共有的真菌OTU。E1中的独立细菌OTU数量最高，E1和E46中的独立真菌OTU数量较高。由此可知，E1含有一系列具有相对高丰度的独特细菌物种和真菌物种，而两次的翻仓操作导致大曲中独特细菌物种和真菌物种的丰度降低，在翻仓之后随着继续发酵大曲中独特细菌物种和真菌物种的丰度回升。这些结果表明，翻仓操作会导致大曲曲块内细菌和真菌群落多样性以及丰富度发生明显变化。

为明确大曲制造过程不同阶段的微生物群落组成，从门和属水平对大曲样品进行了分析。图4A、B展示了不同阶段大曲在真菌门和属水平上的变化。在真菌门水平上，子囊菌门（Ascomycota）、毛霉门（Mucoromycota）、担子菌门（Basidiomycotad）的丰度较高，在不同样品中它们的相对丰度之和接近100%。在属水平上，共检测到139 个属，其中14 个属的相对丰度大于1%，占总真菌群落的94.31%～97.79%。在大曲制造初期（E1），曲霉属（Aspergillus）、根霉属（Rhizopus）、根毛霉属（Rhizomucor）、交链孢属（Alternaria）、unclassified_o_Saccharomycetales为优势菌属，热子囊菌属（Thermoascus）、嗜热真菌属（Thermomyces）、红曲霉属（Monascus）、毕赤酵母属（Pichia）、丝衣霉属（Byssochlamys）、节担菌属（Wallemia）、附球菌属（Epicoccum）、异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces）、Apiotrichum为次优势菌属，其他属为稀有菌属。

在E1中Thermoascus和Thermomyces的相对丰度较低，仅为1.49%和1.77%，而经历两次翻仓操作之后Thermoascus的相对丰度分别增加到31.22%和70.96%，Thermomyces的相对丰度分别增加到16.18%和28.52%。在E46中Thermoascus的相对丰度回落至25.76%，Thermomyces的相对丰度回落至15.50%。它们能够适应大曲曲块堆积发酵产生的较高温度，从而在E7和E14中相对丰度上升，而在E46中随着曲块温度的降低，它们的丰度也有所降低。赵慧君等对滨州地区高温和中温大曲的真菌群落组成研究发现，Thermoascus和Thermomyces是高温大曲中的优势菌属，并且在高温大曲中的平均相对含量高于中温大曲；与本研究结果一致，进一步证实了高温环境对这些菌属生长的促进作用。Monascu是在白酒发酵中起关键作用的一类真菌，其在E1中的相对丰度仅有0.11%，样品E7中增加到43.72%，而随着发酵的进行在E46中降低到0.28%。另外，在E1中，unclassified_o_Saccharomycetales、Aspergillus、Rhizopus、Pichia、Rhizomucor的相对丰度较高，分别为22.54%、11.00%、19.43%、6.79%、13.27%，在群落中占优势。但随着两次翻仓的进行，它们的相对丰度也逐渐下降，在E7和E14中成为稀有菌属。而在发酵46 d后，unclassified_o_Saccharomycetales、Aspergillus、Rhizopus、Pichia相对丰度回升至24.34%、6.69%、6.48%、10.92%，重新在群落中占据优势。

图4C、D展示了不同阶段大曲在细菌门和属水平上的变化。在细菌门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）、蓝藻门（Cyanobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）为优势菌门。Firmicutes是最主要的优势细菌门，在E1、E7、E14、E46中分别占总丰度的87.90%、89.32%、95.72%、94.03%。Actinobacteria在大曲制造过程中的丰度总体呈现先上升后下降的趋势，在E7中的相对丰度（10.66%）最高。而Proteobacteria和Cyanobacteria则呈现相反的趋势，在E1中丰度最高，经历两次翻仓在E7和E14中丰度降到最低，在E46中丰度回升。在细菌属水平上，共检测到69 个属，其中优势属有12 个，占细菌群落总数的93.53%～99.96%。尽管不同阶段的大曲样品中的细菌群落差距较大，但总体来看，芽孢杆菌属（Bacillus）、枝芽孢菌属（Virgibacillus）、火山渣芽孢杆菌属（Scopulibacillus）、海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）、克罗彭斯特菌属（Kroppenstedtia）是优势菌属（平均相对丰度大于10%），葡萄球菌属（Staphylococcus）、片球菌属（Pediococcus）、考萨考氏菌属（Kosakonia）、unclassified_o_Chloroplast、魏斯氏菌属（Weissella）、高温放线菌属（Thermoactinomyces）是次优势菌属（平均相对丰度在10%～1%之间）。

在E1中Bacillus的相对丰度为60.64%，在两次翻仓过程中其相对丰度有所降低，而随着后续的发酵其相对丰度逐渐增长，在E46中达到69.29%。Huang Ping等对不同生产模式制作过程中的大曲细菌群落组成研究发现，Bacillus是酒曲制造过程中最主要的细菌属，并且在制造过程中温度较低的前期和后期生长更为活跃，与本研究结果较为一致。Scopulibacillus和Staphylococcus的变化趋势与Bacillus相似。Bacillus在大曲中扮演着至关重要的角色，它们能够在发酵过程中产生蛋白酶、淀粉酶、糖化酶等关键酶类，水解原料中的大分子物质，生成丰富的发酵前体物质，并通过美拉德反应等复杂的生物化学反应促进吡嗪类、酸类、芳香族等对酱香风味贡献显著风味物质的形成。而Virgibacillus、Oceanobacillus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia的相对丰度则呈现先上升后下降的趋势。Virgibacillus在E1中的相对丰度仅为0.37%，在E7中上升到46.48%，在E14中回落到30.93%，并最终在E46中降低到2.09%。这可能是由于大曲制造过程中的两次翻仓改变了曲块的温度和透气性，从而提高了这些菌属在大曲中的相对丰度。结果表明大曲制造过程中的两次翻仓操作对大曲中细菌和真菌的群落组成具有十分显著的影响。

3 大曲挥发性风味成分分析

在大曲的成型和发酵过程中，微生物的代谢活动导致了大量挥发性化合物的产生。这些化合物直接参与风味化合物的形成或作为前体，对酱香型白酒的品质起着至关重要的作用。对于翻仓操作前后的大曲中的挥发性物质进行了鉴定和定量，并进行Z-score归一化，绘制热图（图5）。在大曲制造过程中总共鉴定出49 种挥发性物质，包括12 种酯类、9 种吡嗪类、6 种醇类、6 种醛类、5 种酮类、3 种酚类、2 种醚类、2 种呋喃类、1 种烯烃类、1 种酸类及2 种其他物质。酯类物质是高温大曲中一类重要的挥发性化合物，种类最多。其中正己酸乙酯、辛酸乙酯、棕榈酸乙酯在大曲发酵过程中含量较高。乙酯是形成白酒典型风味特征的关键化合物之一，对白酒的整体风味平衡和层次感起着至关重要的作用。随着翻仓过程的进行，正己酸乙酯的含量逐渐升高，在E14中达到最大值1 713.61 μg/kg。辛酸乙酯在发酵初期含量较高，为672.01 μg/kg，在E7中显著降低，在E14中又升高至473.67 μg/kg。经过后续长时间的发酵，在E46中正己酸乙酯和辛酸乙酯的含量均显著降低。棕榈酸乙酯有助于减少白酒中的异味和刺激感，对白酒风味有着重要影响。棕榈酸乙酯的含量在大曲制造过程中呈现出先增加后减少的趋势，在E1阶段，含量相对较低，但在E7阶段，棕榈酸乙酯的含量显著上升，达到530.09 μg/kg。随后，在E14和E46阶段，棕榈酸乙酯的含量逐渐下降。除酯类外，醇类物质也是大曲制造过程中的重要挥发性物质。2,3-丁二醇是合成功能物质2,3,5,6-四甲基吡嗪的前体物质，随着曲块的发酵含量降低。2-苯乙醇具有玫瑰样花香，也是中国白酒中非常重要的香气化合物，在E1中含量为420.70 μg/kg，在E14中达到峰值2 759.90 μg/kg，之后在E46中含量降低到577.74 μg/kg。吡嗪类物质是大曲制造不同阶段中最主要的一类挥发性化合物，含量最高，这与邓阿玲等的研究相符。其中2,3,5,6-四甲基吡嗪约占吡嗪类物质总量的87%～95%。2,3,5,6-四甲基吡嗪含量在大曲制造过程中呈现先减少后增加的趋势。在初期E1和E7阶段，2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量较高，随后在E14阶段显著下降。然而，随着发酵过程的继续，特别是在E46阶段，2,3,5,6-四甲基吡嗪的含量再次显著上升，达到整个制造过程中的最高值。在大曲进行第二次翻仓操作之后，检测到更多种类的风味物质，例如呋喃类、醚类、醛类物质。呋喃类物质通常具有独特的焦香、豆香，醚类物质则具有独特的香气，丰富了香气种类，而醛类物质则主要提供果香和奶香，例如苯乙醛具有甜香和花香，壬醛则具有油脂、甜橙味，这些风味物质在大曲的制造过程中被转化与富集，可增加基酒风味的复杂性与层次感。综上所述，生产过程对大曲挥发性风味成分的形成具有决定性影响，是塑造酱香型白酒独特风味的关键环节。

4 微生物与挥发性风味成分之间的相关性分析

在大曲的制造过程中，两次翻仓操作会导致微生物丰度动态波动，而不同微生物的生命代谢活动也影响了挥发性风味成分的动态变化。分析微生物与风味成分之间的关系有助于识别潜在的功能微生物群，并适当调控大曲制造过程的风味形成。制造过程不同阶段的大曲样品中的挥发性成分与微生物（属）之间的潜在关联关系通过Spearman相关性分析进行了评价。图6A展示了优势真菌属与挥发性风味成分的相关性热图。大部分真菌属与三甲基吡嗪、3,5-二乙基-2-甲基吡嗪、2,3-丁二醇、2,3-丁二酮、2,3,5,6-四甲基吡嗪等吡嗪类物质及其前体物质呈正相关，包括Aspergillus、Rhizopus、Rhizomucor、Alternaria、Byssochlamys、Wallemia、Epicoccum、Wickerhamomyces、Apiotrichum。这些真菌属与正己酸乙酯、乙酸苯乙酯、9,12-十八碳烯酸正丙酯、棕榈酸乙酯等酯类物质以及异戊醇、苯甲醇等醇类物质呈负相关。Thermoascus和Thermomyces则与之相反，它们与酯类物质和醇类物质正相关，而与吡嗪类物质呈负相关。Pichia和unclassified_o_Saccharomycetales与2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯乙醛和壬醛呈正相关，与异戊酸呈负相关。

图6B中的结果显示，Virgibacillus、Oceanobacillus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia、高温放线菌属（Thermoactinomyces）与正己酸乙酯、反油酸乙酯、棕榈酸乙酯、亚油酸乙酯等酯类物质呈正相关，而与白酒中的重要风味物质2,3,5,6-四甲基吡嗪及其前体物质乙偶姻、2,3-丁二酮、2,3-丁二醇都呈负相关。而其他细菌属如Scopulibacillus、Pediococcus、Kosakonia、Staphylococcus、unclassified_o_Chloroplast和Weissella则与酯合成表现出负相关，而与2,3,5,6-四甲基吡嗪及其前体物质表现出正相关。此外，Oceanobacillus和Kroppenstedtia还与愈创木酚、3-苯基呋喃、2,3-二氢苯并呋喃、邻苯二甲醚、4-甲基苯甲醚以及大部分醛类物质都呈正相关。细菌属Bacillus与2,3,5,6-四甲基吡嗪、苯乙醛和壬醛的代谢合成呈正相关。

综合分析结果表明，细菌属中的Virgibacillus、Oceanobacillus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia、Thermoactinomyces以及真菌属中的Thermoascus和Thermomyces对于酯类物质的合成具有重要贡献，而Thermoascus和Thermomyces则有助于醇类物质的合成，为酯类物质的合成提供了原材料，这可能是它们对于酯类物质的合成表现出正相关的根本原因。而细菌属中的Scopulibacillus、Pediococcus、Kosakonia、Staphylococcus、unclassified_o_Chloroplast、Weissella和Bacillus以及大部分真菌属都有助于吡嗪类物质的合成。此外Oceanobacillus和Kroppenstedtia有助于合成呋喃类、醚类以及醛类物质，Bacillus、Pichia和unclassified_o_Saccharomycetales有助于合成苯乙醛和壬醛。

在大曲发酵过程中，微生物快速生长产生大量的生物热，导致发酵谷物的温度升高。温度是大曲微生物群落演替主要环境理化驱动因子，随着时间的推移，温度变化对微生物群落和风味物质的形成产生了显著的影响。在翻仓过程中，大曲温度升高，为耐热微生物如Thermoascus和Thermomyces提供了适宜的生长条件，促进了这些微生物的增殖，从而在微生物群落中占据了优势。同时，高温环境增强了微生物的代谢活动，导致大量挥发性风味物质的产生，尤其是酯类物质的合成显著增加，如正己酸乙酯和辛酸乙酯等，这些物质对白酒的风味品质至关重要。随着翻仓次数的增加，曲块内的温度变化促使微生物群落结构发生调整，同时风味物质的种类和含量也随之变化，例如在第二次翻仓后，呋喃类、醚类、醛类等更多种类的风味物质被检测到，增加了风味的复杂性与层次感。因此，翻仓操作通过调节大曲的温度环境，不仅影响了微生物群落的演替，也驱动了风味物质的形成和变化，对酱香型白酒独特风味的形成起到了重要作用。

5 结论

本研究比较了酱香型大曲制造过程两次翻仓操作前后的微生物群落演替以及挥发性风味物质的变化。这两次翻仓过程导致了大曲体系中微生物的重新分布以及微生物群落的调整与重组。其中Virgibacillus、Oceanobacillus、Saccharopolyspora、Kroppenstedtia、Thermoascus和Thermomyces在两次翻仓过程中相对丰度显著增加。翻仓操作后大曲曲块中的正己酸乙酯、辛酸乙酯和2,3,5,6-四甲基吡嗪含量上升，且有更多种类的风味物质被检测到，例如呋喃类、醚类、醛类物质等。结果显示大曲曲块内的酿造核心功能微生物群落的更迭影响了其挥发性风味物质的合成。相关性分析表明，Oceanobacillus、Kroppenstedtia、Thermoascus和Thermomyces与正己酸乙酯合成呈正相关。此外，许多低丰度真菌属和细菌属如Staphylococcus及Pichia等都与2,3,5,6-四甲基吡嗪的合成呈正相关。本研究初次探讨了酱香型高温大曲制备过程中两次翻仓操作对于曲块发酵过程的微生物群落以及风味物质形成的影响，对于深入理解大曲内微生物群落演替与发展驱动发酵进程的风味等物质代谢规律，探究酱香型高温大曲生物学特性的品质差异根源以及影响酱酒酿造风味物质形成规律提供基础数据，为高温大曲生产制定有效工艺策略提高品质稳定性提供重要参考。

作者简介

通信作者

李秀婷，教授，女，工学博士，北京工商大学食品与健康学院教授，博士生导师，北京市三八红旗奖章以及茅以升北京青年科技奖获得者。中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会常务理事、副秘书长，中国食品科学技术学会酶制剂分会理事，中国食醋产业技术创新战略联盟理事。主要从事传统发酵食品应用基础、新型酶资源及功能微生物挖掘、酶分子特性及催化机制、食品酶资源应用及功能性食品研发等方面的研究工作。近年来，主持或完成国家自然科学基金重点项目1 项，面上项目5 项，国家重点研发计划课题2项及企业合作研发项目多项。以第一或通信作者在《Trends in Food Science & Technology》《Food Hydrocolloids》《International Journal of Biological Macromolecules》《Food Research International》等SCI期刊发表学术论文百余篇；出版学术专著2部，主编教材2部；授权国家发明专利30余件；作为第一完成人获中国商业联合会科技进步特等奖、神农中华农业科技奖二等奖、教育部高等学校科学研究优秀成果奖（科学技术）二等奖等各1 项。

第一作者

丁泽，男，北京工商大学食品与健康学院2022级硕士研究生，专业是食品科学与工程，研究方向为微生物与酶工程。在研究生期间参与国家自然科学基金重点项目1 项。目前以第二作者在《International Journal of Biological Macromolecules》国际期刊发表研究文章1 篇。

本文《酱香型高温大曲制作过程中微生物群落演替规律与风味物质变化》来源于《食品科学》2025年46卷第11期115-124页，作者：丁泽，陈曦，李金洋，牛家亮，杜秉昊，李微微，龙尧，郎莹，孙宝国，李秀婷。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241114-109点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：安宏琳；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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