浙江
原理
PCR 反应特异性扩增的一个关键条件是引物的正确设计，使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。
用途
合理的引物设计有利于得到特异性的产物
步骤
一、引物设计原则
1.引物长度：PCR 的特异性通过引物长度和退火温度控制，一般 16-24 个碱基。
注：引物长度（primer length）常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于 74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。
2. G+C 含量：G+C 的含量一般控制在 40-60% 左右。
注：GC 含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的 Tm 值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50% 寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 5~10℃。若按公式 Tm= 4（G+C）+2（A+T） 估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 55~80℃，其 Tm 值最好接近 72℃ 以使复性条件最佳。
3.碱基随机分布。为避免 PCR 产物的突变，一般不建议 3' 端连续相同的碱基，并且目的片段的某一序列连续多个相同碱基的位置，极容易出现突变。
注：引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3' 端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3′ 端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 GC 富集序列区错误引发。
二、实验步骤
1.目的片段的获取
设计引物取决于待扩增的目的片段。在 NCBI 首页的搜索框的下拉菜单中选择 Gene，再在对话框中输入目的基因的名称；选择对应的来源之后，选择对应需要的亚型，将其编码基因的 CDS 区域保存。
来源：NCBI 官网截图
2.引物的设计
引物设计方法很多。用 Oligo7 软件打开保存的序列，将光标拉至扩增序列的最前端，点击 Edit，里面选择 Edit forward primer，系统默认 21 个碱基，按照 A/undefined2+C/undefined4 计算引物的 Tm 值，一般 Tm 值在 54-64 之间，可根据这个范围调节引物的长度。调整完成之后将这段编辑后的序列按 5'-3' 的方向复制到 Excel 表格中，同样的方法设计后引物并复制到 Excel 表格。
3.引物的调整
按照质粒构建的方法，在前后引物的 5' 端加上酶切序列（T4 连接酶的方法）或 15-20 bp 的载体酶切位点附近的载体序列（同源重组的方法），按照载体上的酶切序列编码情况，还需要在前引物 ATG 起始前加入碱基以免编码错位，以及确认后引物是否需要终止密码子。
注意事项
1.注意正反向引物都是 5'-3' 的方向；
2.注意前引物中可能存在错码的可能以及后引物的提前终止。
常见问题
一、PCR 没有产物或二聚体太多
1.引物设计错误，特别是没有注意后引物的方向；
2.调节 PCR 时退火温度；
3.提高模板的质量或模板的使用量；
4.设计新的引物。
二、构建的质粒不能编码基因
1.没有注意前引物的移码突变问题；
2.没有注意后引物终止密码子的问题；
3.排除其他情况下，换载体。
来源：丁香实验
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