Nature丨多世代单细胞追踪揭示姐妹细胞异质性如何产生

撰文丨章台柳

细胞异质性包括遗传和非遗传异质性，在自然界中普遍存在，但在细胞群体的整体行为中却未得到充分体现 。 细胞中的随机过程，如转录、翻译、蛋白质周转和细胞分裂等过程，会导致细胞 组成 和生化反应的波动，进而引发表型变异。这种随机变异可能会被确定性因素缓冲或放大， 但其中大部分确定性因素并不为人所知。

表型可塑性是癌症的一个显著特征，大多数肿瘤表现出遗传和非遗传的时空异质性，会影响肿瘤对癌症治疗的适应性和抗性。由突变、选择和克隆扩增驱动的经典达尔文体细胞进化似乎不足以完全解释癌症进展和对治疗的反应。此外，塑造癌症基因组进化和适应性的基因组损伤通常不会在单个细胞周期内得到解决，而是会分离到后续的细胞世代中。遗传和非遗传异质性如何相互 作用 ，以及表型异质性如何出现并在细胞世代间传递的动态过程，目前仍未得到充分理解。

肿瘤发生 的一个主要驱动因素是癌基因诱导的复制应激。内源性和癌基因诱导的复制应激会产生可遗传的 DNA 损伤，这些损伤会通过细胞分裂传递给子细胞。在子细胞中，遗传的基因组损伤会调节 G1 期持续时间，并决定细胞是进入静止期还是进入细胞周期。它们受到染色质阅读器 53BP1 的束缚， 53BP1 可保护它们免受降解，并调节它们在下一个 S 期的复制时间【1】。虽然 53BP1 标记的染色质疤痕代表了基因组损伤遗传的一种模式，但它们是否会影响姐妹细胞异质性并传递到后续细胞世代尚不清楚。

近 日 ， 来自 瑞士 苏黎世大学 的 MatthiasAltmeyer 团队 在 Nature 杂志上发表文章 Multigenerational cell tracking of DNA replication and heritable DNA damage ，利用基于内源性标记蛋白的多代单细胞追踪技术以及定制设计的计算工具，来阐明致癌扰动如何诱导姐妹细胞不对称性和表型异质性。基于双 CRISPR 的基因组编辑能够同时追踪 DNA 复制模式和可遗传的内源性 DNA 损伤。在异步生长的细胞中追踪多达四代的细胞谱系树，并通过 顺序 染色将时间分辨谱系分析与细胞周期和 DNA 损伤标记物的终点测量相结合。除了揭示复制和修复动态、损伤遗传以及多代细胞中姐妹细胞异质性的产生外，通过与单细胞转录组学相结合，还描绘了常见致癌事件如何触发多条通向多倍体化的途径，且对基因组完整性产生不同的结果。研究提供了一个在单细胞水平剖析表型可塑性的框架，并为揭示可能类似于癌症发展早期事件的细胞过程提供了思路。

为了开发出能够同时追踪多个细胞世代中单个细胞及其命运的技术， 研究人员 首先稳定表达异位 H 2 B - GFP ，这样明亮的细胞核 H 2 B - GFP 信号有助于软件辅助的图像 分割；其次稳定表达异位 mEGFP -53 BP 1 ，这样足够明亮的信号可用于追踪单个细胞中的 DNA 损伤，且 53BP1 标记的内源性 DNA 损伤可以在多个细胞世代中进行定量追踪 ；再次 ， 使用 CRISPR-Cas 9 将 TP 53 BP 1 的最后一个外显子框内融合 mScarlet - I 编码序列，来克服异位蛋白过表达相关的局限性；最后 使用 CRISPR-Cas 9 将复制因子 PCNA 最后一个外显子框内融合 mEmerald 标签，便于将 可遗传 DNA 损伤的时间分辨测量与 DNA 复制模式相结合 。 与亲代细胞相比，经过基因编辑的双标记细胞显示出正常的增殖、未受干扰的细胞周期谱以及对 DNA 损伤的正常反应 ，且未检测到光毒性。 53BP1-mScarlet 会在内源性 DNA 损伤位点和诱导的 DNA 损伤位点形成核修复凝聚物 ， 内源性 PCNA- mEmerald 信号标记了 S 期的活跃复制区域，这些区域局限于 EdU 阳性细胞。对 PCNA 复制模式的 分析 能够在异步生长细胞的单细胞谱系中进行细胞周期分期 ，且内源性 PCNA 信号可用于多代细胞追踪。 同时，研究人员将用于谱系分析的多代延时显微镜观察与追踪细胞的顺序荧光染色技术相结合，这样可以观察其他应激标记物在其中的变化。

研究人员获得了 55 小时多代活细胞成像（涵盖多达三个细胞世代）的单细胞轨迹 和 通过顺序染色获得的终点测量结果 。 未经处理的异步生长细胞具有相对明显的细胞周期时相转变，子细胞在细胞分裂后的 G1 期持续时间和 S 期起始方面几乎没有异质性，并且细胞核面积在细胞周期中逐渐增大，直至有丝分裂。通过 53BP1 测量的 DNA 损伤水平较低，且大多局限于 G1 期，孙细胞世代的 γH2AX 、 p53 和 p21 处于本底水平， pRb 水平较高。相比之下，处于 G2 期的异步生长细胞经低剂量 APH （ DNA 聚合酶抑制剂） 处理后，子细胞世代的 S 期进入受到干扰，而从 S 期正常退出进入 G2 期以及正常细胞分裂似乎不受影响。然而，与未处理细胞相比，孙细胞的 γH 2AX 和 p53 水平升高，单个孙细胞表现出高 p21 和低 pRb ，这与 S 期进入缺陷相关 。当异步生长细胞在 G2 期用 ATR 抑制剂（ ATRi ）处理时，下一个细胞周期似乎延长了，姐妹细胞表现出 DNA 复制受干扰、 S 期持续时间存在异质性，同时出现 53BP1 焦点形成，以及 γH2AX 和 p21 的诱导表达 。敲低 p 53 或 p 21 加速细胞周期进程，并与 APH 和 ATRi 协同作用， 导致复制受干扰、 DNA 损伤增加和细胞异质性增强 。 这些结果揭示了复制应激（ APH 或 ATRi 诱导）、检查点信号缺陷（ ATRi 诱导）或肿瘤抑制功能缺失（ p53 、 p21 敲低诱导）如何诱导细胞异质性，这可能是加速细胞转化和耐药性演变的基础。

进一步探究异质性的潜在来源，发现电离辐射（ IR ）诱导的 DNA 损伤后基因表达存在差异，单细胞测序揭示了主要参与DNA复制、修复和细胞分裂的基因是DNA损伤诱导的细胞异质性的主要驱动因素。53BP1 需通过其寡聚结构域进行 寡聚化 ，以在 DNA 损伤位点形成焦点，且表现出相分离特征，而这极易受蛋白质浓度 影响。研究发现虽然 TP53BP1 的表达未被显著诱导 ，但 53BP 1 募集受其核内浓度限制，且细胞间 53BP1 的异质性会影响对 DNA 损伤的反应。 这种急性 DNA 损伤会引起可遗传的变化。 即使亲代 DNA 中发生一次短暂的基因毒性事件，也可能导致持续存在的基因组疤痕，从而影响下一代细胞的细胞周期进入和复制时间，导致姐妹细胞之间的不对称性增加，以及细胞群体内的表型异质性增加。或者，受损的 DNA 可能会将在 DSB 修复和复制叉保护中具有双重功能的蛋白质从复制工厂中隔离出来，从而间接影响复制保真度，又或者像断裂 - 融合 - 桥事件这样的异常修复过程可能会诱导姐妹细胞异质性。这些机制并非相互排斥，它们共同表明一次基因毒性事件能够在细胞群体中诱导异质性和持久的表型变化。 此外，基因毒性应激可诱导多倍体化，且常见癌基因的激活会诱导类似的表型异质性和多倍体化。

总的来说， 这项 研究开发了一种用于定量多代单细胞追踪和谱系分析的方法，并揭示了致癌、复制应激和DNA损伤下，姐妹细胞异质性如何产生。

https://www.nature.com/articles/s41586-025-08986-0

制版人： 十一

参考文献

1. Lezaja, A. & Altmeyer , M. Dealing with DNA lesions: when one cell cycle is not enough.Curr.Opin. Cell Biol.70 , 27–36 (2021).

2. Spies, J. et al. 53BP1 nuclear bodies enforce replication timing at under-replicated DNA to limit heritable DNA damage.Nat. Cell Biol.21 , 487–497 (2019).

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