木质素，最新Nature Synthesis！

木质素的增值利用对于实现经济可行且可持续的木质纤维素生物精炼厂至关重要。然而，昂贵的辅因子需求和较低的转化率阻碍了木质素成分的增值利用。

鉴于此， 上海交通大学 倪俊 教授 通过整合辅酶再生和无细胞表达，报道了 一种 体外多酶协同 表达与辅因子自循环（ iMECS ）策略，以实现高效的木质素到分子的转化 。 iMECS 系统建立了 一个高原子经济性的催化桥，将木质素废料转化为有价值的芳香族化合物 。姜黄素、香兰素和覆盆子酮以无辅酶的方式高效合成，转化率超过90%。 作者 还展示了 iMECS 平台的灵活性 ，通过该平台可以通过酶交换和途径延伸轻松获得多种苯丙素类化 合物。 通过将化学解聚与 iMECS 系统相结合，富含木质素的农业废弃物被直接转化为有价值的化学品， 其总催化效率与已报道的效价相比提高了48倍 。这一高效通用的平台可以 促进木质纤维素生物质的利用 ，从而推动零废弃生物精炼厂的发展，实现更可持续的未来。 相关研究成果以题为“ Chemoenzymatic platform with coordinated cofactor self-circulation for lignin valorization ”发表在最新一期 《 Nature Synthesis 》上。

【 木质素生物高值化的三条竞争路线 】

木质素是地球上最丰富的可再生芳香族碳源，但传统生物升级路线 要么大量 耗费 ATP / CoA / NAD(P)H 等辅因子，要么 在多酶失衡 时产率骤降。作者提出的 体外多酶协同 表达-辅因子自循环（in-vitro Multi-Enzyme-Coordinated expression with cofactor Self-circulation，简称 iMECS ）把无细胞蛋白合成与专用辅因子回收模块结合起来，成为 “第三条道路”。

图1 示意图 并列对比： （1） 纯化酶级联 ：每一步都需外加ATP／CoA／NAD(P)H，放大困难； （2） 全细胞发酵 ：细胞内拥挤和转运瓶颈使 多酶表达 失衡，产率低； （3） iMECS ：完全在无细胞裂解液中运行，辅因子由自循环模块再生，可通过调节DNA投量迅速平衡所有酶活。图中紫、绿、粉三色箭头直观标注能量/辅因子流向，突出 iMECS 同时解决“辅因子税”与“酶活失配”两大痛点。

图 1.木质素生物价值化不同途径的示意图

【 iMECS 蓝图：从阿魏酸（FA）到姜黄素 】

首先，图2 (a–c) 路径设计 ： 作者 将植物 4CL 替换为 Caldimonas thermodepolymerans FCS，使 1 mM FA 的 姜黄素终浓度 由 28.1 mg L ⁻ ¹ 提至 115.3 mg L ⁻ ¹ 。再引入 MatB 与 PPK 构建 ATP/CoA 循环，终浓度升至 126.4 mg L ⁻ ¹ ，仅需催化量辅因子。 然后， 图2 (d–e) 无细胞实现 显示： 同时表达 4CL、CUS、 MatB 、PPK 的裂解液，在 不 额外添加辅因子时仍产 51.2 mg L ⁻ ¹ 姜黄素，证明循环模块可利用内源池自启动。 最后，图2 (f–g) 显示了 机器人优化 ： 液体工作站一天筛选 1 296 组质粒配比，最佳 FCS: CUS:MatB :PPK =2:1:3:2，生产率 0.175 g L ⁻ ¹ h ⁻ ¹ ，摩尔转化率 95.31%，较经典全细胞方法高出 14.5 倍。

图 2 . iMECS 策略用于从 FA 进行体外生物合成姜黄素

【 耐热型 iMECS 制备香兰素 】

阿魏酸 → 香兰素需 FCS 与 ECH。作者把副产乙酰-CoA 接入 PTA/ACK/PAP 三酶循环，再生 ATP 并释放 CoA，理论 ATP 需求下降 67%。 净化五酶体系 在 1 mM FA 上得 94.4 ± 2.7 mg L ⁻ ¹ 香兰素 （图3a，b） 。将反应温度由 30 °C 升至 50 °C 可失活裂解液中 的嗜温醇脱氢酶 ，消除香兰醇副产； C. thermodepolymerans ECH 仍保留 ~60% 活性 （图3c-e） 。双质粒裂解液遂得 106 mg L ⁻ ¹ 香兰素且无醇副产 。 五质粒耐热 i MECS调优 FCS:ECH : PTA:ACK :PAP=2:3:1:2:2，生产率 1.79 g L ⁻ ¹ h ⁻ ¹ ，转化率 98.21% （如图3f所示） 。

图 3 . 用于将 FA 转化为香兰素的耐热 iMECS

【 三重辅因子循环的 iMECS 合成覆盆子酮（RK） 】

上游 FCS + Rheum palmatum BAS 生成 103.7 ± 4.9 mg L ⁻ ¹ 4-HBA；配合 MatB + PPK 回收，免辅因子产 82.3 ± 5.8 mg L ⁻ ¹ 。下游 E. coli CurA 还原 4-HBA 至 RK，FDH 循环 NADPH 后，免 NADPH 产 113.6 ± 4.0 mg L ⁻ ¹ RK。六质粒体系免辅因子产 118.9 mg L ⁻ ¹ RK，但组合空间庞大。作者将 CurA 与 FDH 以 GGGGS 链接融合，将质粒数降至四，再优化得生产率 0.15 g L ⁻ ¹ h ⁻ ¹ 、转化率 91.56%，较文献微生物路线高 48 倍。对比实验表明，盲目将 FCS–BAS 融合反而让产量降八成，凸显数据驱动融合的重要性。

图 4.基于 iMECS 的 RK 生物合成与三辅因子循环

【 化学 - iMECS 杂交流程处置真实木质素 】

以 STS 取代 BAS 或以 CHS+CHI 组合，可无辅因子合成白藜芦醇（57.9 → 211.3 mg L ⁻ ¹ ，转化率 92.58%）和柚皮素（122.3 → 229.1 mg L ⁻ ¹ ，转化率 84.2%）。温和碱水解玉米芯、小麦秸等生成富 FA 料流（用于姜黄素/香兰素），甘蔗渣、咖啡渣等生成富 p-CA 料流（用于 RK/白藜芦醇/柚皮素）。直接投加等同 1 mM 单体的水解液，可得 77.5–173.9 mg L ⁻ ¹ 产物，体积速率 1.86–36.50 g L ⁻ ¹ d ⁻ ¹ ，转化率最高 83.38%，比此前纯底物体系高 1.23–35.89 倍 。

图 5 .化学- iMECS 混合路线用于木质素增值

【 结论与展望 】

本文 证明： （1） 概念突破 ： iMECS 通过辅因子自循环免除 ATP/CoA/NADPH “ 税”， 同时可精确配比表达量，克服传统纯酶级联与全细胞路线的根本瓶颈。 （2） 快速优化 ：机器人 DNA 滴定可日筛千级组合，使姜黄素转化率达 95%，香兰素生产率超 1.7 g L ⁻ ¹ h ⁻ ¹ 。 （3） 工程弹性 ：温度门控与理性蛋白融合提高选择性、降低质粒维度，覆盆子酮产率达 0.15 g L ⁻ ¹ h ⁻ ¹ ，为文献最高值的 48 倍。 （4） 原料适应性 ：化学 - iMECS 杂交能直接将农林废弃物中的木质素转化为五种高值酚丙烷类化合物，体积速率多为克级/天， 为“零废弃”生物炼制奠定基础 。

作者强调， 无细胞裂解液反应可从微升线性放大至 100 L 以上；若结合更廉价的裂解体系，辅因子能源可由多磷酸甚至电能、光能供给， iMECS 有望把木质素从低值锅炉燃料升级为数十亿 美元级 的芳香族原料平台。 这些数据充分展示了： 对曾被代谢网络“红 tape”锁住的复杂天然产物，辅因子自循环的无细胞合成已成为现实可行的第三条道路。

来源：高分子科学前沿

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