做WB为何最好要用无蛋白封闭液？

Western Blot（WB），又叫蛋白质免疫印迹，是一种基于抗原抗体的特异性结合，半定量检测样品中某种蛋白的技术手段。在现有的实验技术中，WB仍然是分子生物学、生物化学和免疫遗传学研究中最常用的一种实验方法，整个实验操作过程虽看似简单，但想要获得好看的结果图，却并不容易，很多研究者得到的WB结果图往往存在背景高，条带不清晰，阳性信号不明显等问题，而出现类似结果的原因很可能是WB封闭液用的不对，下面我们一起来了解一下关于WB封闭液的相关知识以及如何选择WB封闭液。

一、WB封闭液的原理

在Western blot实验中，固相载体表面（如NC膜或PVDF膜）存在许多空隙，蛋白转移到膜上后，抗体可能会非特异性地结合到这些空白位置。WB封闭液的作用便是占据这些空白位置，避免非特异性结合，从而减少实验背景噪声。

二、常用WB封闭液种类及其优缺点

WB封闭液的选择对实验结果的清晰度和准确性至关重要。以下是几种常用的WB封闭液及其优缺点：

1、脱脂奶粉：便宜，易于获得，适用范围相对BSA（牛血清白蛋白）窄，由于牛奶中含有生物素，如正在使用抗生物素蛋白-生物素检测系统，则脱脂奶粉不适用，同时也不适用于磷酸化蛋白的检测。

2、BSA：成分单一，适用于多数情况，但价格较高，且可能在提纯过程中混有IgG（免疫球蛋白G）或其他血清蛋白，增加非特异性背景，不可封闭Fc受体（免疫球蛋白Fc部分c末端的受体），如有免疫原偶联BSA，也不可用。

3、全血清：如胎牛血清、兔血清等，与BSA适用范围相似，且可封闭Fc受体，但由于含有多种蛋白质，可能会与抗体产生交叉反应，导致背景信号高，且价格较昂贵。

4、明胶（gelatin）：一般鱼皮明胶效果最好，不含血清蛋白，减少了交叉反应，降低了背景信号，但含有内源性生物素，不适合用于生物素-抗生物素检测系统。

5、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)：是一种非蛋白质的封闭剂，为水溶性多聚物，与硝酸纤维素和PVDF膜结合快，但只在检测小分子蛋白时比较有效。

6、快速封闭液：不含血清和生物素的单一纯化蛋白，在多种抗体和抗体组合中性能良好，与链霉亲和素系统兼容，15分钟内完成封闭，适用于需要剥离和再次检测印迹的蛋白，但由于仍含有蛋白成分，依然存在产生交叉反应的可能性。

7、无蛋白快速化学封闭液：纯化学成分、不含任何蛋白成分，可避免抗体与封闭剂的非特异结合，特别适用于脱脂奶粉、BSA无法有效封闭、存在交叉反应的封闭场景，且该封闭液有助于充分暴露抗原位点，无空间阻隔，能显著提升免疫检测的灵敏度，封闭也仅需10分钟，具有快速高效的特点。

三、WB封闭液的选择标准

1、全能性

WB封闭液的“全能性”是指能够应用于各种WB封闭场景，而不会因为存在共同抗原而导致出现交叉反应的性能。这一点是研究者在进行WB封闭液选择时最需要关注的方面，也是决定目的蛋白条带背景是否清晰、阳性信号是否明显的关键要素。

显然、像脱脂奶粉、BSA、全血清等类型的WB封闭液并不满足这一性能，而快速封闭液由于或多或少含有蛋白抗原成分，也会有出现交叉反应的可能，因此建议研究者选择WB无蛋白快速化学封闭液。据了解，市面上宣传无蛋白的快速封闭液有很多，但真正纯化学成分的WB封闭液并不多，研究者可使用像BIOG品牌的WB无蛋白快速化学封闭剂这类产品，组分是纯化学成分，不含任何蛋白质抗原成分，因此对于像磷酸化蛋白检测、一抗或二抗与牛奶、BSA存在交叉反应情况下的WB检测尤其适用，实验者也无需陷入封闭液选择的困扰。

2、背景低，信噪比高

每一位研究者在进行WB实验时，对理想实验结果的标准都是一样的，那就是获得背景清晰，信噪比高的目的蛋白条带。这一点对于封闭液来说，就非常考验其成分以及封闭性能。

我们使用了大家最常用的脱脂奶粉和市面上常见的两款快速封闭液，在保持其他实验条件一致的情况下，进行了封闭效果的比较。实验结果如下图所示，图A为脱脂奶粉的封闭效果，目的条带较为清晰，但稍有背景，隐约有非特异性条带；图C为某知名品牌封闭液封闭效果，可见目的条带，但背景杂乱不均一，非特异性条带较为明显；图B为BIOG WB无蛋白快速化学封闭剂II，目的条带较其他两款封闭液的结果更为清晰，信噪比更高，且背景非常干净，可以说几乎无背景。我们研究推测，可能是得益于BIOG的产品为纯化学成分、不含蛋白抗原物质的原因，因此对蛋白转印膜上的非特异性抗体结合位点封闭的更加彻底，也就利于特异性抗原位点的暴露，从而促进抗原抗体的特异性结合，最终提升了免疫检测的灵敏度。

3、封闭效率高

传统WB封闭液一般使用5%的脱脂奶粉或5%的BSA（TBST配制），然后将蛋白转印膜完全浸泡在封闭液中，室温下封闭1 h或4℃过夜。整个封闭过程时间较久，对于一些新手或迫切想取得实验结果的研究者来说并不友好，而且很多“实验小白”在刚接触到WB实验时，尚未对每种封闭液的性能和优缺点有明晰的认知，很可能花费了时间和精力但最后由于封闭液使用不当而导致与抗体产生交叉反应，结果不理想。因此，研究者可以选择WB无蛋白快速化学封闭液来进行实验，不仅可以将封闭失败的风险降到最低，而且封闭时间也仅需数分钟，以上述提及的BIOG的无蛋白快速化学封闭液来说，只需10分钟就可以充分封闭，封闭效率显著优于脱脂奶粉和BSA。

最后，希望正在经历WB实验洗礼的研究者和即将开始WB实验的新手们，都能少走弯路，取得理想的实验结果！