《AHM》微创、高透光率、胶粘剂和抗氧化水凝胶复合物，用于治疗视神经病变和视网膜病变

研究背景

氧化应激由自由基和抗氧化剂不平衡引发，导致活性分子积累，与心血管疾病、癌症、糖尿病、免疫疾病及青光眼、糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性（AMD）等视网膜疾病的发生发展密切相关，视网膜组织因高代谢活性和持续暴露于光线易受氧化应激影响，过度的光照会增加活性氧（ROS）的产生，加剧氧化应激并损害视网膜细胞，视网膜色素上皮（RPE）、光感受器和视网膜神经节细胞（RGC）特别容易受到氧化损伤，这种损伤会导致视力丧失和细胞死亡。视网膜疾病治疗最新进展集中在基因治疗、干细胞治疗和药理学创新上，但现有治疗存在高成本、对复杂医疗保健基础设施需求及潜在长期安全问题等限制。为应对挑战，研究重点转向开发用于玻璃体内注射的富含抗氧化剂的水凝胶，这些水凝胶通过直接靶向氧化应激提供持续和局部治疗效果，由亲水性聚合物组成的可注射水凝胶彻底改变了微创医学治疗，能融入生理环境、提供持续功能性能并参与组织修复。明胶因生物相容性和多功能性广泛用于组织工程，基于明胶的生物材料常被改性以调节或增强性能，但明胶甲基丙烯酰（GelMA）缺乏特定治疗特性和注射性，限制了其应用，为此开发了基于抗氧化明胶的水凝胶，如GelCA、没食子酸共轭的明胶掺入明胶羟苯基丙酸形成的水凝胶及Gtn-HPA和HA-Tyr偶联水凝胶等，这些水凝胶能改变人类视网膜祖细胞的细胞行为，是潜在细胞疗法中细胞递送的有前途选择，此外，具有强大抗氧化和抗炎特性的咖啡酸（CA-2OH）因其与天然粘合剂成分结构相似性，可增强水凝胶粘合性能，在组织修复应用中具有潜在有效性 。

主要内容

在本研究中，我们借助碳二亚胺反应以及与微生物转谷氨酰胺酶（mTG）的酶促交联，开发出创新的明胶 - 咖啡酸（GelCA - 2OH）和明胶 - 咖啡酸寡聚物（GelCAo2OH）水凝胶，同时采用氧化法使咖啡酸低聚化以增强水凝胶的生物粘附性和抗氧化性能。这些水凝胶专为玻璃体内注射设计，旨在向受损视网膜组织局部且持续输送抗氧化剂，通过融合明胶的结构优势与咖啡酸及其低聚物的强大抗氧化特性，可有效减轻氧化损伤。此外，我们在视神经挤压（ONC）模型中评估了这些水凝胶的体内功能与治疗效果，以期推动视网膜疾病治疗的发展。

图 1.咖啡酸改性明胶水凝胶的合成和应用在视网膜内组织修复中的应用。CA 被氧化形成 CAo，然后与明胶偶联并使用 mTG 交联以产生 GelCAo-2OH 水凝胶。水凝胶显示 ROS 水平、炎症和 RGC 死亡显著降低。这突出了它作为抗氧化剂的有效性、相容性以及玻璃体内注射的适用性。CA，咖啡酸;Cao，咖啡酸低聚物;mTG，微生物转谷氨酰胺酶;ROS，活性氧，RGC，视网膜神经节细胞。

图文速览

咖啡酸改性明胶水凝胶的合成

图 2a 展示了 GelCA-2OH 和 GelCAo2OH 的合成，即咖啡酸通过羧基与明胶氨基形成胺键共价结合。为确认结合成功，将 GelCA-2OH 的紫外 - 可见光谱与未修饰明胶和咖啡酸光谱比较，发现明胶 - 咖啡酸偶联物在 294 nm 和 318 nm 处有对应 CA2OH 的吸收峰，且 GelCAo2OH 组特征峰吸光度值增加，表明 CA2OH 成功整合到明胶骨架；质子核磁共振波谱进一步验证，CA-2OH 有特征化学位移，合成样品谱图显示与 CA-2OH 对应的额外峰，证实咖啡酸成功掺入明胶基质；采用茚三酮反应测定胺取代水平，发现 GelCA-2OH 和 GelCAo2OH 组颜色强度和吸光度值低于未修饰明胶组，计算得 GelCA-2OH 的功能化程度（DoF）为 15.3% ± 0.1%，GelCAo2OH 的为 22.7% ± 0.3%，低胺取代水平表明需增强改性策略；传统偶联方法因明胶偶联位点有限致儿茶酚结合低，故实施涉及 CA-2OH 寡聚化的先进方法，在 EDC/NHS 偶联前将咖啡酸氧化成低聚物，显著增加邻苯二酚含量，Arnow 测定证明儿茶酚浓度和吸光度存在线性关系（R = 0.9963），且 GelCAo-2OH 中的儿茶酚含量显著高于 GelCA-2OH（分别为 16.9 和 10.2 μg mg），是 GelCA-2OH 的 ≈1.7 倍，表明通过寡聚化成功增强明胶功能，符合增强明胶生化性质的目标 。

图 2.咖啡酸改性水凝胶的合成和化学表征。a） 使用 mTG 酶溶液用咖啡酸低聚物进行明胶功能化和 GelCAo-2OH 的酶促交联示意图。b） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的紫外-可见光谱。c） 咖啡酸、明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的 1 H NMR 波谱。d） 改性和未改性明胶中咖啡酸功能化程度（SD ±平均值，n = 3）。e） 儿茶酚浓度的标准曲线（520 nm 处的吸光度）。f） 修饰和未修饰明胶中儿茶酚含量的鉴定（SD ±平均值，n = 3，统计显着性表示如下：** P < 0.01 和 **** P < 0.0001，通过双向方差分析后跟 Tukey 事后检验）。

咖啡酸改性明胶水凝胶的交联动力学和可注射性

我们开展详细流变学分析以研究水凝胶高级物理化学性质，使用复杂流变仪观察从与 mTG 整合的改性和未改性明胶溶液开始、在室温下酶促交联的凝胶化过程，通过优化重量浓度确定 3 wt% 为最佳浓度，所有配方储能模量（G′）和损耗模量（G“）逐渐增加，凸显 mTG 加速凝胶化的作用，但 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的 G′ 值低于未修饰明胶，可能因儿茶酚修饰干扰明胶天然三螺旋结构、阻碍有效网络形成，且交联效率受空间位阻影响；观察到 GelCA2OH 和 GelCAo-2OH 水凝胶粘度随剪切速率提高显著降低，幂律模型显示其流动指数（n 值）和稠度指数（K 值）均低于明胶，明显的剪切稀化行为表明咖啡酸改性增强了水凝胶在剪切应力下变粘稠的能力，利于细针挤出应用；水凝胶光学图像显示明胶高透明度，透射率平均值为 80.98%，GelCA-2OH 呈乳白色，平均透射率为 35.9%，归因于咖啡酸官能团掺入影响光学特性，添加氧化试剂后咖啡酸氧化使 GelCAo-2OH 色偏过渡且透明度降低，不过 GelCAo-2OH 透射率略高于 GelCA-2OH，可能因儿茶酚整合破坏水凝胶网络内聚力，减少内部光散射，尽管 GelCA-2OH 和 GelCAo2OH 透射率均低于明胶但仍保持一定透明度，且二者均具有可生物降解性，注射到眼睛中可在体内逐渐降解以降低阻碍视力风险；评估水凝胶体积和透射率关系表明，注射的 GelCAo-2OH 和 GelCA-2OH 保持高光学清晰度，在小鼠眼睛 ONC 模型体内抗氧化性能研究中注射 ≈10 μL 水凝胶进行治疗，可最大限度减少对视觉功能的影响 。

图 3.咖啡酸改性明胶水凝胶的交联动力学和注射性评估。a） 添加 mTG 溶液 10 分钟和 30 分钟前后明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的照片。b） 使用 mTG 溶液评估 GelCA-2OH 溶液酶促交联的实验设计。c） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的时间依赖性储能模量 （G′） 和损耗模量 （G”）。d） 通过 30G 针头注射 GelCAo-2OH 水凝胶。e） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的光学图像。f） 使用透射仪测量明胶、GelCA2OH 和 GelCAo-2OH 的透明度（SD ±平均值，n = 3，统计显着性表示如下：* P < 0.05，通过双向方差分析，然后进行 Tukey 事后检验）。g） GelCAo-2OH 水凝胶的粘度曲线以及 1 至 100 秒的剪切速率。

咖啡酸改性明胶水凝胶的机械性能

对改性和未改性明胶水凝胶的振荡流变学分析显示，当振荡应变从 1% 增加到 1000% 时，G′ 相对降低，估计明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的临界振荡应变分别为 259.73%、259.01% 和 253.95%；进行一系列从低（1%）到高（300%）应变的三个循环应变测试后，与同等浓度未修饰明胶水凝胶相比，咖啡酸修饰的水凝胶尤其是 GelCAo-2OH 组的 G′ 值变化最小，计算出的明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的 G′ 平均修复率分别为 63.0% ± 3.8%、93.9% ± 3.6%、99.0% ± 2.7%，表明咖啡酸修饰水凝胶具有卓越的自愈能力，这归因于通过增强的π - π 相互作用和咖啡酸中酚羟基的氢键形成的密集结区网络，使其在应力下可转变为流体状态并恢复原始机械特性，展现出用于玻璃体内注射的潜力；为阐明压缩力下的材料特性，分析改性和未改性水凝胶的压缩行为，应力 - 应变曲线揭示机械响应差异，未改性明胶在 1.0 应变下承受的最大应力约为 15 kPa，改性的 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝胶的峰值应力分别为 6.6 和 4.1 kPa，GelCAo-2OH 抗压强度降低尤为明显，证实早期流变学发现，表明软材料特性，这种抗压强度降低可能因结构儿茶酚整合诱导的改变，儿茶酚基团虽旨在增强交联但也可能削弱水凝胶网络内聚力，定量杨氏模量测量也支持该假设，明胶模量为 3.2 ± 0.4 kPa，超过 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的模量（分别为 1.7 ± 0.4 和 1.0 ± 0.2 kPa），表明邻苯二酚添加引起的结构修改可能引入复杂性，如空间位阻，影响水凝胶的压缩弹性 。

咖啡酸改性明胶水凝胶的粘附性能

评估 CA 改性明胶水凝胶粘附性能的实验装置采用以猪皮为基材的拉伸强度测试，制备猪皮样品并粘附在基于明胶的水凝胶上以保证接触一致，随后将组件放入配备夹具固定样品的机械测试设备中。对粘合测试数据分析发现，粘附强度 - 位移曲线显示 GelCAo-2OH 粘附强度最高，在 ≈35 kPa 达到峰值，GelCA-2OH 约为 26 kPa，未改性明胶水凝胶为 18 kPa，进一步量化与统计分析最大粘合强度值也证明 GelCAo-2OH 粘合性能明显优于 GelCA-2OH 和明胶，其增强的粘合强度可归因于儿茶酚基团密度增加，促进了与猪皮的有效相互作用，该结果凸显了 CA 改性明胶水凝胶在需强大粘附力的生物医学应用中的潜力。

图 4.咖啡酸改性明胶水凝胶的机械和粘附性能评估。a） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝胶的储能模量 （G′） 和损耗模量 （G“） 以及从 1% 到 1000% 的振荡应变。b） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝胶的储能模量 （G′） 和损耗模量 （G“） 以及 1% 至 300% 之间的 3 次应变循环。c） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝胶在 1% 和 300% 之间的 3 个应变循环后 G′ 恢复率（SD ±平均值，n = 3，统计显着性表示如下：*** P < 0.001 通过双向方差分析，然后进行 Tukey 事后检验）。d） 基于明胶的水凝胶的机械压缩测试的实验装置。e） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的应力-应变曲线。f） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的杨氏模量（SD ±平均值，n = 3，统计显着性表示如下：** P < 0.01 和 *** P < 0.001，通过双向方差分析后跟 Tukey 事后检验）。g） 粘附在两块猪皮之间的水凝胶粘合强度测试的实验装置。h） 明胶、GelCA2OH 和 GelCAo-2OH 的粘附强度。i） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的最大粘附强度（SD ±平均值，n = 3，统计显着性表示如下：* P < 0.05 和 *** P < 0.001，通过双向方差分析后跟 Tukey 事后检验）。

咖啡酸改性明胶水凝胶的结构分析和生物降解

我们借助扫描电子显微镜（SEM）在微米尺度检查发现，未改性明胶水凝胶呈相对均匀紧凑的多孔 3D 形态，而 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 孔结构更异质、不规则，GelCAo-2OH 孔结构更多样化，这归因于儿茶酚基团整合破坏了明胶基质均匀性；显微计算机断层扫描（Micro-CT）分析显示，儿茶酚修饰使水凝胶孔隙率略有增加，孔径也有所扩展，GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 内部组成更碎裂、不紧凑，这些形态变化可能影响水凝胶机械性能，降低其承受压缩力能力，表明基质内有效交联减少，凸显邻苯二酚修饰在增强生化特性与损害结构内聚力和机械稳健性间的微妙平衡对改性水凝胶临床应用的重要性；明胶、GelCA2OH 和 GelCAo-2OH 水凝胶均表现出快速吸水率，4 小时内稳定在 ≈300%，GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 孔隙率增加可能增强其保持水分能力，利于细胞迁移和增殖，且邻苯二酚引入的结构修饰未损害明胶亲水性，水凝胶保持所需水分含量，平衡的吸水能力及调整后的孔隙率说明其在眼部应用中具有发挥最佳功能的潜力；在酶降解方面，改性水凝胶尤其是 GelCAo-2OH 比未改性明胶降解更快，这种加速降解利于视网膜组织修复，避免长期异物并发症，GelCAo-2OH 降解速度更快，适用于需瞬时支持的应用，孔径和结构碎裂增加可能增强酶可及性，可优化降解速率；水凝胶降解时接枝的咖啡酸会释放，释放实验表明，通过 EDC/NHS 化学将咖啡酸偶联到明胶上能有效稳定官能团，7 天后 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 仅释放极少量咖啡酸，验证了化学改性的稳定性；分析释放动力学对了解水凝胶治疗潜力和生物利用度至关重要，通过将数据拟合到五个不同模型，发现樋口模型最能描述 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的释放动力学，该模型在现代药物输送技术中发挥重要作用，能准确预测释放速率，是配方设计的宝贵工具 。

咖啡酸改性明胶水凝胶的抗氧化活性

为探索水凝胶在视网膜保护方面尤其是具有增强抗氧化能力水凝胶的功效，我们聚焦于以抗氧化和抗炎特性闻名的 CA-2OH。在受控条件下，通过 2,2-二苯基-1-三硝基苯肼（DPPH•）测定评估不同浓度 CA-2OH 的自由基清除效率，发现低浓度（0.125 mg mL）CA-2OH 清除自由基非常有效，中和率超 90%，凸显其强大抗氧化能力，且 DPPH• 测定中水凝胶性能进一步证明其抑制自由基能力，CA-2OH 和 CAo2OH 与明胶结合显著增加 DPPH• 抑制，体现咖啡酸整合增强抗氧化活性，不过向明胶添加大量羟基使抗氧化效率适度提高，表明修改有效性存在潜在阈值；进一步研究水凝胶清除超氧阴离子（O•）能力，实验显示标准明胶水凝胶 O• 清除能力适中，仅为 ≈11%，而添加咖啡酸显著提高明胶水凝胶清除能力，GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 样品清除效率分别达 48.1% ± 2.0% 和 53.9% ± 1.5%，结合 DPPH• 清除测试结果，表明咖啡酸掺入后水凝胶 ROS 清除效率显著提高；此外，利用电子顺磁共振（EPR）波谱评估水凝胶 ROS 清除能力，对照组观察到 DPPH• 自由基特征峰，明胶组峰值强度降低但仍可检测，而 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 组未观察到明显峰值，表明咖啡酸修饰后其抗氧化能力显著增强，这些发现与 DPPH• 测定和硝基蓝四唑（NBT）测定结果一致 。

图 5.咖啡酸改性明胶水凝胶的形态、物理和化学性质评估。a） 扫描电子显微镜图像，说明明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝胶的横截面形态（比例尺：400 μm）。b） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的吸水动力学（SD ±平均值，n = 3）。c） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 水凝胶的显微 CT 图像。d） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的酶降解曲线（SD ±平均值，n = 3）。e） DPPH• 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo2OH 的清除活性（SD ±平均值，n = 3，统计显着性表示如下：*** P < 0.001，**** P < 0.0001，通过双向方差分析后跟 Tukey 事后检验）。f） 明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的清除活性（SD ±平均值，n = 3，统计显着性表示如下：* P < 0.05 和 **** P < 0.0001，通过双向方差分析，然后进行 Tukey 事后检验）。g） 比色变化对应于不同测定条件下水凝胶制剂中抗氧化活性的存在和功效。

咖啡酸改性明胶水凝胶的体外生物相容性

为评估 CA 修饰和未修饰的明胶水凝胶的体外生物相容性，我们依据 ISO 10993-5 标准，分别采用细胞计数试剂盒 8（CCK-8）和活/死测定进行定量与定性评估，这些测定对评估水凝胶与源自小鼠视网膜且广泛用于视网膜疾病研究的 RGC-5 细胞和 661W 细胞的相互作用至关重要。CCK-8 检测作为定量评估细胞活力的方法，结果显示所有水凝胶制剂组细胞活力与在组织培养板对照上培养超过 48 小时的细胞活力相当，表明水凝胶中不存在破坏细胞代谢的细胞毒性试剂，证实其适合用于治疗；活/死测定从定性角度支持该发现，与水凝胶提取物孵育 48 小时后，大多数细胞呈绿色荧光（表明活力），仅有最小红色荧光（表明细胞死亡），进一步证实了水凝胶的无毒性质及其有效支持细胞活力的能力。

图 6.咖啡酸改性明胶水凝胶的体外生物相容性性能。a） 暴露于水凝胶提取物的 RGC-5 细胞在 48 小时时的活/死染色（比例尺：400 μm）。b） 暴露于水凝胶提取物的 RGC-5 细胞在 4、24 和 48 小时时的活力比较（平均 ± SD，n = 3）。

咖啡酸改性明胶水凝胶的体外抗氧化性能

为全面评估咖啡酸修饰的明胶水凝胶 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 的抗氧化特性，我们利用 RGC-5 细胞在过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化应激下开展体外测定实验，借助能精确定量细胞内 ROS 的荧光探针二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）进行评估。实验将 RGC-5 细胞暴露于含 500 μm H₂O₂的培养基模拟氧化环境，以此评估各水凝胶变体的保护功效。DCFH-DA 测定呈现荧光指示 ROS，定量分析表明，与仅用 H₂O₂处理的对照组相比，GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 组的 ROS 积累显著减少，虽两种制剂抗氧化活性均有效且性能差异小，但即便 GelCAo-2OH 咖啡酸浓度较高，在降低 ROS 水平方面也仅略优于 GelCA-2OH，荧光强度测量证实了这一点，凸显了 CA 浓度与水凝胶抗氧化功效的相关性。ROS 逐渐降低且咖啡酸增加，表明明胶结构修饰既能保持细胞活力，又能增强细胞微环境以防止氧化损伤，这对如视网膜疾病治疗等普遍关注氧化应激的临床应用尤为有利，突出了 CA 修饰水凝胶作为视网膜组织修复中针对氧化应激治疗策略的潜在价值。

图 7.咖啡酸改性明胶水凝胶的体外抗氧化性能。a） 使用 DCFH-DA 和 Hoechst 染色（比例尺：200 μm）定量评估暴露于水凝胶的 RGC-5 细胞中的 ROS 清除和细胞核可视化。b） RGC-5 细胞培养物中水凝胶处理和 ROS 染色的实验时间表。c） 在氧化应激下用水凝胶处理的 RGC-5 细胞的相对 DCFH-DA 荧光强度（平均值± SD，n = 3，统计显着性表示如下：** P < 0.01 和 **** P < 0.0001，然后进行 Tukey 事后检验）。

咖啡酸改性明胶水凝胶的体内生物相容性性能

为研究不同水凝胶制剂的体内生物相容性，我们对健康小鼠进行玻璃体内注射，并分别在注射后即刻（第 0 天）和注射后 7 天（第 7 天）评估视网膜组织完整性。初步观察及第 0 天的组织学分析证实水凝胶成功输送至玻璃体腔，第 7 天的后续评估显示，所有水凝胶组的关键视网膜层完整性得以保持，详细组织学染色表明神经节细胞层（GCL）、内核层（INL）或外核层（ONL）均未出现破坏。这些发现表明水凝胶耐受性良好，无诱导细胞丢失、组织变性或炎症反应的证据，视网膜结构的保留及无不良反应凸显了水凝胶与视网膜组织的相容性，支持其在眼部疾病治疗应用中的潜在效用，也突出了这些水凝胶制剂在提升再生眼科临床结果方面的潜力。

图 8.咖啡酸改性明胶水凝胶的体内生物相容性性能。a） 可注射水凝胶体内生物相容性测试的时间表。b） 第 0 天和第 7 天视网膜组织对 PBS、明胶、GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 反应的组织学分析（比例尺：50 μm）。

咖啡酸改性明胶水凝胶在 ONC 模型中的体内抗氧化性能

我们通过在 6 周龄雌性癌症研究所（ICR）小鼠中建立视神经夹伤（ONC）模型来评估 CA 修饰和未修饰的明胶水凝胶的抗氧化功效，先对小鼠麻醉并实施精确外科手术暴露视神经，用交叉作用镊子对视神经施加 10 秒受控压力以建立氧化应激模型。ONC 诱导后，将水凝胶制剂直接注射到眼睛玻璃体中研究原位治疗潜力，重点评估水凝胶调节视网膜组织中氧化应激的能力，使用对 ROS 敏感的二氢乙锭（DHE）染色定量评估氧化应激，氧化后 ROS 发出荧光可可视化和量化视网膜组织内氧化应激水平。DHE 染色视网膜切片的显微镜分析及量化显示，与 PBS 处理的 ONC 对照组相比，两种水凝胶制剂都显著减少 ROS 积累，富含最高咖啡酸浓度的 GelCAo2OH 水凝胶使荧光强度降低最明显，表明咖啡酸含量增加可能增强水凝胶抗氧化特性，且 ROS 在视网膜神经元各层（GCL、INL 和 ONL）积累，咖啡酸的抗氧化性能在实验组各视网膜层均有良好记录，尤其在 GelCA-2OH 和 GelCAo2OH 组。总体而言，咖啡酸修饰的水凝胶有效减轻 ONC 后视网膜组织的氧化应激，其抗氧化能力对保护和再生视网膜神经元组织的治疗应用至关重要，在损伤或疾病诱导的氧化应激条件下，这些水凝胶降低 ROS 水平、减轻氧化损伤的能力，突出了它们在临床治疗视网膜神经退行性疾病的潜在效用。

图 9.咖啡酸改性明胶水凝胶的体内抗氧化性能。a） 小鼠视网膜中 ROS 诱导和水凝胶治疗的时间表。b） 暴露于水凝胶的视网膜组织中的相对 DHE 荧光强度（SD ±平均值，n = 3，统计显着性表示如下：**** P < 0.0001 通过双向方差分析，然后是 Tukey 事后检验）。c） 使用视网膜组织的 DHE 染色可视化 ROS 积累，包括 GCL、INL 和 ONL（比例尺：100 μm）。

咖啡酸改性明胶水凝胶处理 RGC 的体内存活率

为证实水凝胶治疗效果，我们评估视网膜细胞存活率（图 10a 展示相关实验示意图）。RBPMS 是 RNA 结合蛋白，在视网膜 RGC 中选择性表达，是识别和量化视网膜组织中 RGC 的可靠标志物，常用于估计眼神经病变等情况下的 RGC 丢失。RBPMS 免疫荧光染色结果（图 10c）显示，PBS 注射无 ONC 的对照组 GCL 无显著降低或变性，而 ONC 组注射 PBS 后 RBPMS 阳性细胞显著减少，表明神经节细胞显著丢失；ONC 后用明胶处理的组 RBPMS 阳性细胞减少，与 ONC 组细胞丢失一致，表明未修饰明胶不能治疗急性 ROS 损伤的视网膜组织；相反，与 ONC 组相比，GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 注射组 RBPMS 阳性细胞增加，表明对 RGCs 有保护作用，可防止视神经损伤后 RGC 丢失。图 10b 的 RGC 密度统计分析证实，ONC 减少 GCL 中细胞数量，而 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 注射显著减轻了这种减少。

图 10.用咖啡酸改性明胶水凝胶处理的 RGC 的体内存活率。a） 小鼠视网膜中 ROS 诱导和水凝胶治疗的时间表。b） RBPMS 细胞的定量分析，以及代表性成像。（SD ±平均值，n = 4，统计显着性表示如下： ** P < 0.01 和 **** P < 0.0001，通过双向方差分析，然后进行 Tukey 事后检验。c） 用 RBPMS 对视网膜细胞进行免疫荧光染色，用 Hoechst33342 对视网膜细胞进行核染色（比例尺：100 μm）。

此外，我们对 RPE 进行全安装染色以观察组织和 RGC 的 3D 结构（全安装过程见图 S10），结果显示与对照组相比，ONC 组 RBPMS 信号明显较弱，明胶组略高，而 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 均将 RBPMS 信号恢复到与未处理对照组相当水平；为量化水凝胶保存 RGC 的治疗效果，使用 ImageJ 软件自动细胞计数，发现 GelCAo-2OH 组 RGC 细胞总密度和比例显著增加，GelCA-2OH 和明胶组无显著改善。值得注意的是，这些发现与组织学切片染色结果不同，切片染色实验中 GelCA-2OH 和 GelCAo-2OH 组在 RBPMS 阳性细胞计数或体内抗氧化性能方面无显著差异，这表明切片染色因主要提供单层透视，在捕获细胞和组织完整 3D 结构方面受限。总体而言，RPE 整装分析表明 GelCAo-2OH 对视神经损伤后 RGC 丢失更有效，这种保护作用可能源于其增强减轻氧化应激的能力。为进一步评估水凝胶对视神经损伤的保护和再生作用，进行 GAP-43 轴突染色，结果显示 ONC 治疗后荧光强度显著降低、细胞密度显著降低，而 GelCAo-2OH 注射组荧光强度显著恢复，表明其在促进轴突再生方面潜力广阔。

图 11.用咖啡酸修饰的明胶水凝胶处理的 RGC 体内存活的全量分析。a） 10× 物镜下的代表性图像（比例尺：1 毫米）。b） RPE 整个安装的示意图，包括全视场视图和四个放大区域。c） 40× 物镜下的代表性图像（比例尺：100 μm）。

图 12.a） 总细胞密度和 b） RGC 细胞密度的定量分析，以及代表性成像。（均值± SD，n = 4，统计显着性表示如下： * P < 0.05，** P < 0.01，**** P < 0.0001，通过双向方差分析后跟 Tukey 事后检验。c） RGC 细胞比率的定量分析，计算方法是 RGC 细胞数除以总细胞数。

参考文献

Kai-Hsiang Chang, Jwu-Jiun Wei, Guan-Yu Lan, Yi-Ke Lin, Yu-Ting Lin, Ta-Ching Chen, and Jiashing Yu

Minimally Invasive, High Transmittance, Adhesive and Antioxidative Hydrogel Complex for Treatments of Both Optic Neuropathy and Retinopathy

ADVANCED HEALTHCARE MATERIALS

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https://advanced.onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202501583

来源：纳米医韵