快速封闭液助力WB免疫印迹检测

Western blot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，尽管已经非常普遍，但研究者想要获得一张好看WB实验图却并不容易，常常会遇到检测时出现非特异性条带、背景杂乱等情况，导致这种结果的原因有很多种，除了蛋白本身、抗体的原因以外，封闭液的选择和使用也非常重要。下面我们就从产生非特异性显色的原因、常用封闭液的特点以及新型无蛋白纯化学成分封闭液三方面详细展开来说一说。

一、非特异性显色的原因

1、非特异性吸附

在分析WB结果中出现非特异性显色的具体原因前，我们首先需要了解一下WB实验中为何需要封闭过程，这里要跟大家提到一个“非特异性吸附”的概念。在WB实验中，蛋白质通过电泳分离后要先被转移到固相载体如PVDF膜、NC膜、或其他适用膜上，然后才能被免疫检测。然而，无论是PVDF膜、或是NC膜等，膜表面都存在很多一抗、二抗和显色底物的非特异吸附位点。如果不进行封闭处理，在后续抗体孵育和显色过程中，一抗、二抗或显色底物就会被非特异性地吸附到膜上，干扰目标蛋白的检测，导致高背景信号。因此，封闭的步骤就显得尤为重要，是确保WB实验成功和减少非特异性显色的关键环节。在实际操作中，封闭液的选择、封闭时长、封闭温度等等都会影响到封闭是否完全，如果没有彻底封闭住固相载体上的这些非特异性吸附点位，就会出现高背景显色，导致实验结果不理想甚至整个实验失败。

2、抗原抗体交叉反应

上述内容我们从非特异性吸附的角度来阐述了出现背景信号的原因，但还有另一种这就是我们接下来要说的“非特异性结合”导致的非特异性显色，主要来源于抗原抗体的交叉反应。不同的蛋白质如果存在共同抗原，就会发生抗原抗体交叉反应。如细胞膜信号通路蛋白多为磷酸化蛋白，而脱脂奶粉中也含有大量磷酸化蛋白，因而检测信号通路蛋白的很多抗体也会与脱脂奶粉中的磷酸化蛋白进行结合。检测信号通路蛋白如果用脱脂奶粉封闭，势必会出现交叉反应，导致高背景显色，阳性条带不清晰，影响实验结果的准确性和可靠性。

二、常用的封闭液

知道了非特异性显色的原因后，我们来聊一聊蛋白免疫印迹试验中，最常用的封闭液种类：脱脂奶粉和牛血清白蛋白（BSA）。大多数研究者可能并不了解这两种封闭液的特点，导致应用于一些不合适的封闭场景下时，结果出现非特异性显色。

脱脂奶粉：常见且价格便宜，易于获得，含有多种不同分子量的蛋白，对于许多标准的Western blot实验来说，脱脂奶粉确实能够提供比较不错的封闭效果。但也是因为它的成分复杂，其适用范围相对BSA要更窄，并且牛奶中含有生物素和碱性磷酸酶残留，如正在使用抗生物素蛋白-生物素检测系统，则脱脂奶粉不适用，同时也不适用于信号通路蛋白的检测以及碱性磷酸酶标记的二抗检测，否则会导致非特异性结合和高背景。另外，脱脂奶粉在高温条件下容易变质，产生异味或絮状沉淀。封闭时间上，通常需要在室温下放置1小时，或者4℃过夜，时间较长。

BSA：成分单一，适用于多数情况，如生物素、碱性磷酸酶系统的免疫学检测实验或其他对特异性要求较高的实验。但相比脱脂奶粉来说价格较高，且可能在提纯过程中混有IgG（免疫球蛋白G）或其他血清蛋白，就容易与二抗产生交叉反应，特别是来自于牛、羊、马等种属的二抗，更容易增加非特异性背景。封闭时间上，同样需要在室温下放置较长时间（如2小时）或4℃过夜。

三、新型无蛋白纯化学成分快速封闭液

上述内容，我们剖析了脱脂奶粉和BSA作为封闭液的优缺点，且皆存在封闭短板，研究者必须对于封闭液的特性、目标蛋白的特性以及检测系统的要求非常了解，才能在WB实验中游刃有余，否则很容易陷入实验失败的困境。一款好的封闭液应该是具有封闭所有非特异性结合位点，但不影响目标抗原与抗体的结合，也不与抗体或检测试剂有交叉反应的特性。那么，到底有没有具备这些特性且适合所有封闭场景的封闭液呢？

随着生物领域研究的快速发展，市面上已经出现了纯化学成分、无任何蛋白成分的无蛋白快速封闭液。这种封闭液可应用于任何WB封闭场景，哪怕是脱脂奶粉、BSA或全血清无法适用的如生物素-亲和素偶联系统检测、磷酸化蛋白检测、一抗或二抗与牛奶、BSA存在交叉反应情况下的WB检测，也能获得较为理想的封闭结果。但是，无蛋白封闭液的研发难度较大，市面上真正的无蛋白快速封闭液较少，很多公司声称的无蛋白快速封闭液其实是含有鱼胶蛋白或BSA的变体。我们实验室进行了多次测试，目前只有BIOG WB无蛋白快速化学封闭液达到了比较理想的结果。下图为该款产品和脱脂奶粉的封闭效果比较。结果显示，BIOG的WB无蛋白快速化学封闭液的封闭效果要更好，只需十分钟就可以达到脱脂奶粉一个小时的封闭效果，并且背景较脱脂奶粉的更为干净。不仅如此，我们还对BIOG WB无蛋白快速化学封闭液进行了多场景的封闭效果检测，例如对于磷酸化蛋白的检测、二抗来自于马等可能与脱脂奶粉或BSA产生交叉反应的检测场景等均取得了理想的效果。