从细胞系开发到制剂药品：治疗性单抗的制造技术

摘要：

本综述涵盖了治疗性单克隆抗体的生产和配方挑战和进展，重点关注改进工艺以最大限度地减少变异并确保批次间一致性。将回顾监管机构实施的流程，例如质量源于设计（QbD）和现行的良好生产规范（cGMP），以及它们的实施如何帮助制药公司的药物开发。将讨论治疗性抗体的配方进展和预期用途的考虑因素，包括给药途径和患者依从性。

治疗性单克隆抗体和相关产品已稳步增长，成为生物制药市场的主导产品类别。抗体的生产需要采取特殊的预防措施，以确保产品的安全性和有效性。特别是，最大限度地减少抗体产品的异质性至关重要，因为原料药变体可能会损害抗体的活性、疗效、安全性和药代动力学特性，从而导致产品在临床前和临床开发中失败。

表1：后期临床试验中的mAb候选药物总结

图1：IgG抗体概述

（A）IgG的结构分别以绿色和蓝色显示轻（L）链和重（H）链。聚糖修饰位置N297用红星表示。（B）不同物种中单克隆抗体的N-糖结构。缩写：NeuAc：N-乙酰神经氨酸，Man：甘露糖，Fuc：岩藻糖，GlcNAc：N-乙酰葡糖胺，Gal：半乳糖。

【NO.1】治疗性抗体的生产

1.工业制造和当前的GMP里程碑

多年来，工艺开发的优化工作一直致力于减少工艺时间和每种抗体的开发成本。此外，减少mAb变体、工艺杂质和实现批次间一致性是工艺开发的关键成果。制造过程可以概括为五个步骤：

（1）开发表达目标基因的稳定且高效的细胞系，

（2）在宿主细胞中以高滴度生产所需的抗体，

（3）原料药纯化，

（4）配方步骤和适当的剂型（填充和完成），

（5）分析测试方法来监控过程并评估最终产品。

前两个阶段对应于上游加工（USP）操作，而接下来的三个阶段被认为是下游加工（DSP）活动和在质量控制实验室进行的分析测试操作。由于mAb的结构相似性，可以开发平台工艺技术。平台工艺包括用于细胞培养的宿主系统、用于转化的预制载体、预定义的细胞扩增方案、生物反应器条件、高性能纯化系统和经过充分验证的分析方法。

在mAb生产过程中，最关键的步骤之一是细胞系的选择。细胞必须繁殖良好，在培养物中高度稳定，并在其活性形式下产生高mAb滴度，这意味着蛋白质是折叠正确的，糖基化，而不是聚集。因此，基于这些要求，哺乳动物细胞是最常用的，因为它们适应于高度复杂分子的生产、加工和分泌。中国仓鼠卵巢（CHO）细胞是目前生产的首选。CHO细胞具备快速增殖和高表达滴度特性，以及人类缺乏两个聚糖表位，它们存在于小鼠细胞系中，例如NS0和Sp2/0（图1）。

细胞系工程和开发旨在实现更高的细胞滴度，以提高生产率和产品质量。Gronemeyer等人广泛回顾了细胞培养基、饲料开发、生物工艺开发和放大实验中的优化工作。例如，CHO细胞的工程改造已经产生了能够分泌高达100pg/细胞/天的人源化mAb的细胞系或灌流培养物中80–110pg/细胞/天的嵌合mAb。然而，所采用的补料方法对mAb滴度有直接影响。不同的补料方法有分批补料、分批补料或灌注补料。在分批法中，所有营养物质都被添加到初始培养基中，而在补料分批法中，营养物质在耗尽时被添加。灌流意味着培养基在生长的培养物中循环，同时通过过滤将细胞保持在生物反应器中，去除废物，并为细胞提供新鲜的营养物质。补料分批处理导致mAb滴度为1-5g/L，一些公司报告使用延长培养条件时高达13g/L。

作为生物制药工艺的核心，细胞培养基为宿主细胞提供必要的营养物质和环境，以实现高活细胞密度和高效的mAb表达。补料分批工艺的细胞培养基开发包括分批培养基和饲料浓缩物开发以及补料策略优化。由于细胞系的营养消耗和代谢不同，该优化阶段被认为是细胞系依赖性的。几十年来，完全化学成分明确的培养基一直用于大规模mAb生产。

表2：细胞培养基的成分及其对关键质量属性（CQA）的影响

完全化学成分明确的培养基并不总是能产生高滴度，因此将不含动物成分的水解物添加到培养基中，以提高细胞密度、活力和生产力。表2显示了细胞培养基组分及其对关键质量属性的影响的详细列表。随着灌流培养物的普及，Kuiper及其同事开发了一种基于补料分批培养基和补料的灌流培养基衍生方法。虽然可以进行进一步优化，但CHO培养物从快速衍生的灌注培养基中获得了高生产率和产品质量。除了细胞培养营养物质外，已经表明控制增殖和保持高活细胞密度可以导致更高的产品产量。温度、pH值或CO2水平的变化会极大地影响他们的生产力。正如Kim和Lee所表明的，即使对于来自同一亲本克隆的两个CHO衍生克隆，细胞系也表现出对培养条件和最大抗体浓度的不同反应。

多年来，USP操作已经具备较高滴度和稳定性，重点已转移到DSP作的优化上，特别是提高产量、纯度和降低mAb异质性。在mAb生产后，DSP负责将活性药物成分（API），也称为原料药或原料药（DS））输送到配方和填充（填充和完成）。配制的DS被称为药品（DP），可以直接给患者服用。

连续制造结合了改进的工艺性能和柔性制造的优势。与批量或混合生产系统相比，连续生物工艺在多个问题上具有许多优势。它不仅可以降低资本投资成本，还可以实现灵活和标准化的制造流程，从而有助于及时满足需求。通过使用连续技术减少分子在生物反应器中的停留时间也带来了质量优势。

趋势导致了一次性用品的使用，其好处是具有较低的资本投资和运营成本、更高的灵活性、改进的生产调度和更高的流程复制。

由于下游加工得到的药品已准备好提供给患者，因此必须采取并遵守预防措施和法规，以实现产品质量、安全性、可追溯性和可重复性。cGMP概述了确保生产和测试所需的流程得到明确定义、验证、审查和记录的措施。根据这些定义，确保产品的生产和控制符合其预期用途的质量标准和产品规格的要求。GMP指南基于图2中总结的原则。在严格的GMP实施和控制下，药品可追溯。偏差和变化可以很容易地被追踪，并可以采取相应的行动，以避免在整个过程中使患者处于危险之中或失去药物疗效。

图2：世界卫生组织的良好生产规范指南

2.提高mAb变体的可制造性

在制药和生物技术行业，由于制造性能差，治疗性mAb的开发项目可能会延迟。为了避免与蛋白质稳定性、溶解度或对压力敏感相关的任何问题，在过程的早期进行成药性研究。这些实验包括不同温度下的短期稳定性研究、冻融循环、强制降解研究和高样品浓度下的粘度测定。考虑到原料药和药品质量属性会受到制造过程中微小变化的影响，因此所有步骤都可能对材料质量和患者安全至关重要。因此，必须尽量减少和控制药品中抗体变体的水平。

早在翻译中，就可以通过氨基酸的错误掺入在生产细胞系中形成变体，例如在CHO细胞中丝氨酸而不是天冬酰胺的插入孔。虽然两者都是具有相似物理性质的中性极性氨基酸，但这会导致产生不同的氨基酸序列，这种现象被发现是由细胞培养基中特定氨基酸的饥饿引起的。尽管如此，大多数变体源自翻译后修饰（PTM）或在制造过程中产生。如果药物的改变与稳定性、活性或疗效相关，则被视为关键质量属性（CQA）。

因此，在整个过程中充分表征和控制可能影响药品疗效或安全性的PTM至关重要。

主要质量修饰在文献中被广泛描述，糖基化变异通常会影响药代动力学、抗原结合和免疫原性。治疗性IgG抗体的先验知识和糖工程进展为优化药物的安全性、功能和有效性提供了机会。应用蛋白质工程技术的示例包括氨基酸交换以防止聚集，或避免互补决定区（CDR）中的蛋氨酸残基以防止有影响的氧化。mAb氧化主要发生在蛋氨酸残基上，通过形成蛋氨酸亚砜而产生更多的极性侧链。此外，可以用谷氨酰胺取代N末端残基以减少焦谷氨酸交配时产生的电荷异构体的数量。通过计算机工程和基于结构的理性设计模拟对蛋白质序列修饰的改进，在预测表3单克隆抗体的易聚集区域、稳定性计算和溶解度方面取得了进展。此外，可以通过实验性压力研究（包括温度、pH值和蛋白酶孵育）来监测单克隆抗体的热纳米稳定性的改善，以选择对聚集更具抵抗力的分子。当暴露于不同的温度、pH值和压力条件下时，单克隆抗体体结构可能会发生变化，导致不需要的产品可能表现出免疫原性增加而功效和活性降低。其他蛋白质工程方法已在其他地方描述。总结了导致异质性药品的常见mAb修饰，以及如何解决这些修饰以减少工艺开发过程中的mAb变体。

表3：mAb开发过程中常见的修饰。【描述了修饰引起的异质性类型、其对 mAb的潜在不利影响、其原因以及在DSP操作或通过蛋白质工程技术可能的解决方案。】

为了检测和表征由PTM引起的异质性，研究者不断建立灵敏和定量的先进技术。最近的报告显示了低流量无鞘毛细管电泳-质谱法的使用。可以使用基于质谱（MS）的方法检测微异质性，该方法由高分辨率天然MS和靶向聚糖分析，或通过结合多种技术。涉及4D-LC/MS方法（蛋白A还原-RPLC-酶解-RPLC/MS）的多维设置允许通过在线肽图分析测定PTM水平，包括氧化、脱酰胺和琥珀酰亚胺形成。为了准确检测mAb糖基化模式，使用相同的色谱系统开发了3D-LC/MS工作流程。这种多维工作流程的实施表明了在制造过程中执行快速可靠的PTM监测的潜力。化学修饰（如氧化、脱酰胺和碎裂）会导致电荷异构体，这可能会影响mAb的体外和体内行为。通过改变与靶标的结合行为，组织渗透、分布和药物共动力学可能会受损，因此电荷异构体的分析至关重要。Liuetal.等人重点介绍了修饰产生的酸性变体，描述了自由流动电泳与MS联合的使用。这允许抗体电荷异构体的连续样品分离和液相分离，努力分离不同的电荷异构体并最大限度地减少药品异质性。

除了蛋白质工程工作外，生物制剂工艺开发的中心目标是建立制造技术和工艺，从而在不同批次中产生一致性。大多数质量危机和复杂性都源于产品的设计方式。除了GMP，监管机构还鼓励基于风险的方法，并自2000年代初以来采用了QbD原则。通过提供药物开发指导，QbD旨在促进产品和工艺的设计，最终最大限度地提高产品的功效和安全性，同时提高产品的可制造性。这些原则由人用药品技术要求国际协调委员会（ICH）指南文件ICHQ8-11。

Pharmaceutical QbD的目标包括：

（1）根据临床表现实现有意义的产品质量规范;

（2）通过改进产品和工艺设计，提高工艺能力并减少产品可变性和缺陷;

（3）促进识别故障根本原因的能力;

（4）提高产品开发和制造效率。

在QbD里程碑中，关键质量属性（CQA）确定了从患者角度确保质量所需的产品关键特性。图3总结了几个QbD里程碑。

图3.质量源于设计里程碑摘要

改编自ICHQ11指南文件。缩写：TPP：目标产品概况，QTTP：质量目标产品概况，PRA：过程风险评估，CPP：关键过程参数，非CPP：非关键过程参数，PPQ：过程性能鉴定研究。

为了提高可制造性，QbD范式已被纳入mAb特定场景。Karlberg等人通过利用mAb的结构特性进行定向QbD实施，重新采用了定量构效关系（QSAR）型建模，从而增加了对产品和工艺的理解。对于上游工艺，Nagashima等人将QbD方法应用于CHO细胞中的mAb生产，专注于使用失效模式和影响分析进行质量风险管理。通过这样做，作者确定了可能影响质量属性的潜在关键工艺参数（CPP）和关键绩效指标（KPI），并获得进一步的知识以减轻任何未来的细胞培养相关问题。基因泰克参与了FDA于2008年启动的试点计划，旨在扩大QbD的实施，从而迫切改进以下产品的QbD工具和概念。最近的一份报告还证明了使用与Humira®的阿达木单抗生物仿制药对生物仿制药mAb使用基于QbD的相似性评估的有效实施和可行性。如今，QbD活动已完全整合到产品开发阶段，并导致了更稳健、更高产量的制造工艺，最终提高了临床效率。

【NO.2】制剂开发

与小分子相比，mAbs等生物制药药物因其大分子结构而具有高度特异性和效力。然而，它们的结构复杂性是配方和递送面临挑战的原因。因为可转化性被定义为药品以适合所需给药途径（RoA）或给药方法的方式配制的适用性。其质量属性包括但不限于溶解度、稳定性、粘度和聚集性。早期成型性评估是任何新生物制药开发计划中的一个重要方面，而且往往没有得到足够的重视。根据QbD范式，通常在药物开发的早期阶段，在目标产品概况（TPP）中考虑和定义抗体的预期用途。通过完成TPP，可以在早期阶段解决RoA、剂型、生物利用度和稳定性的问题（图3）。最终，影响抗体疗效、成本或简单性的开发中的每一个方面都可能成为药物成败的区别。

1.给药途径

对于药品，首选的RoA是通过口服给药（非亲本），因为安全性更高、患者依从性好、易于摄入和成本效益。然而，大分子生物制药的缺陷在于，由于对肠上皮的渗透有限，口服给药的生物利用能力有限，只有1-2%，并且由于极性表面电荷和大mAb的MW而增加了对肠腔内酶降解的敏感性。近年来，具有不同RoA的治疗性抗体已被批准用于治疗疾病。mAb最常见的RoA是静脉内（IV）、肌肉注射（IM）或皮下（SC）给药，注射是主要的给药来源（表4）。其他给药方法，例如眼部给药，也存在用于特定部位的药物给药和通过局部治疗降低副作用。与SC或IV相比，由于生物利用度低，IM给药不是mAb的理想给药途径。IV给药通常用于mAb，而IM注射最常用于疫苗。与其他亲本RoA相比，SC注射是最方便的，因为它们有助于患者自我给药并且侵入性最小。然而，尽管如此，由于需要在低注射体积中实现高浓度剂量，因此SC配方在稳定性、聚集体和粘度方面存在考虑限制。

表4：单克隆抗体不同给药途径（RoA）的特性

在药代动力学方面，IV似乎优于SC，因为吸收更快、生物利用度更高、达到最大血清浓度（Tmax）的时间更短，以及相似的消除半衰期（表4）。皮下途径导致吸收缓慢，血浆浓度缓慢增加，Tmax时间延迟，范围为1.7至13.5天。与缓慢淋巴摄取相关的较长Tmax是由于胸导管中1-2mg/kg1h1的流速有限。虽然与IV给药相比，SC途径为患者提供了更多便利，但据报道，SC给药导致更高的免疫致病风险。通过监测抗药抗体（ADA）事件与SC或IV制剂的形成和持续性，比较市售mAb的免疫原性特征来研究这一观察结果。文献中描述了比较治疗性mAb的IV和SC途径的更多示例，以及FDA和EMA批准的mAb的剂量和给药方法的其他示例列于表5中。尽管通过IV或SC途径给药的治疗性mAb很慢，但早期药物开发计划仍在探索新的递送方式生物制药系统。与目前建立的制剂相比，药物载体技术（例如用于调制的纳米颗粒或微胶囊化）具有优越的属性，因此越来越受到关注，因为它们可以提高药物的稳定性和受控释放，同时是侵入性较小的吸入制剂。

表5：FDA批准的几种治疗性mAb的特性（给药途径、给药方式和剂量强度）。缩写：RoA：给药途径，IV：静脉内，SC：皮下，IVP：静脉肾盂造影，PFS：预装注射器，AI：自动注射器。

SC途径的主要限制之一是加样体积有限，这需要高mAb浓度。然而，SC给药技术的进步缓解了注射量限制。现在通过使用体内SC输送系统（例如用于5-10ml注射量的皮内泵和可修补泵）来促进更高的容量，并且预计在未来十年内，允许在自我给药SC途径中允许30ml体积的新技术的报道是可行的。使用大容量可穿戴注射器设备（LVD）还旨在克服SC或IM注射的体积限制，允许高达10ml的注射速度较慢。

2.制剂成药品

配方开发是一个关键方面，因为mAb产品的降解会影响其稳定性和疗效。在早期临床开发中，IV给药通常是首选的RoA，尤其是在进行剂量范围的临床研究时。在早期阶段，目标剂量是未知的，因此强调通过静脉注射实现剂量灵活性，确保100%的生物利用度，并允许在这些关键的早期临床试验中对人体进行全面的PK研究。

根据给药方式的不同，将倾向于使用不同的配方，以提高产品稳定性并确保产品质量。对于IV给药，通常制备用于重构和进一步稀释的冻干粉，以提高产品稳定性。然而，在干燥过程中，该技术会导致物理应力，可能引起不稳定和降解，并导致功效降低。如今，冻干制剂不再是首选，因为它们的制造成本很高，并且在给药前需要进一步稀释。SC和注射给药剂以液体制剂的形式制备并储存在自我给药装置中。然而，液体制剂的缺陷是增加对物理化学降解的敏感性和较低的稳定性，这会影响保质期和产品质量。由于注射是抗体产品的主要给药方式，因此存在不同的产品：传统西林瓶和注射器（VS）、预装注射器（PFS）、预装笔或自动注射器（AI）。虽然PFS的使用带来了用户友好的设计以及患者和经济效益等优点，但由于溶解度、聚集和粘度复杂性，会出现配方问题。因此，需要高达200mg/ml的高蛋白质浓度才能达到治疗剂量，但开发难度限制PFS的发展。

聚集被认为是由表面氨基酸序列上的疏水区域引起的，代表了蛋白质药物最常见的不稳定形式。由于它会降低治疗过程中可用的有效产品，并且通常会导致副作用和免疫原性增加，因此在药品中是非常不可取的。为了减少蛋白质降解和聚集，在注射制剂中添加辅料，遵守欧洲国际药物辅料委员会（IPEC）指南，该指南描述了辅料的质量标准。常用的赋形剂包括盐、氨基酸或糖，以通过中等离子强度或调节溶液的pH值来平衡排斥力和吸引力。糖通过防止干燥状态和干燥状态下的聚集和变性，以及提高其溶出时的熔解温度，可以有效地稳定mAb。表面活性剂（如聚山梨酯）在生物制剂中也用作稳定剂，但高浓度添加此类试剂可能会使蛋白质变性并引起不良副作用，例如注射部位反应。

含有高浓度单个氨基酸的氨基酸基制剂用于稳定和降低粘度。Hung等人重新指出，与使用甘氨酸或海藻糖相比，在mAb制剂中浓缩脯氨酸的使用得到了改进，以提高稳定性并降低pH6下的粘度。通常添加冷冻保护剂，如苏糖或海藻糖，以提高冷冻液体的长期稳定性并避免聚集和变性。使用辅料列表，例如FDA提供的“已批准药品的非活性成分搜索”（www.accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.cfm），为配方科学家提供了来自已批准产品的辅料。此类列表避免了广泛的配方筛选实验。然而，在高浓度剂量下达到目标pH值和赋形剂浓度仍然存在挑战，这可以通过使用粘度用于超滤的下调赋剂或改良的膜盒。

用于筛选预配方的高通量技术允许选择更适合特定配方和交付要求的候选者，并提供有价值的信息以改进工艺设计并提高产量和质量。此外，使用新颖和新兴的技术，如小角X射线散射（SAXS）以及差示扫描量热法（DSC）、动态光散射（DLS）和粘度测量，可用于表征和优化mAb产品的适当赋形剂配方。通过使用纳米材料，如水凝胶、脂质体、mi细胞或纳米颗粒，也可以改进配方以增加治疗性抗体的作用持续时间。使用纳米材料可以持续口服治疗性抗体，同时避免胃肠道降解并保持抗体的稳定性和功能。这允许使用治疗药物来治疗位于胃肠道的感染或局部疾病或类风湿性关节炎等全身性疾病。

3.患者依从性

药物开发和抗体预期用途的核心是以患者为中心。虽然一些配方是为了改善PK/PD特性或安全问题而开发的，但其他配方是为了提高患者的依从性而开发的。由于自我给药的可能性，皮下途径已被证明是最方便的给药途径，具有更高的灵活性和降低患者、付款人和提供者成本的潜力。使用自动注射器、PFS或微型针头进行SC给药提高了患者的接受能力和依从性，但可能引起更高的免疫反应除外。抗体预期用途的考虑因素也必须适合治疗所需的疾病。虽然肠外给药是急性和紧急反应的首选，但非肠外和微创方法更适合持续治疗和慢性给药。患者依从性是实现成功治疗结果的关键方面。报告显示，发达国家患者对慢性治疗的依从率仅为50%，发展中国家甚至更低。因此已经开发了新技术，例如大容量可穿戴注射器装置（LVD），允许在灵活的时间和地点自行给药，希望加入患者因素并促进药物在慢性病中的持续使用。

还必须检查特殊人群，特别是当疾病与特定人群之间存在特定相关性时。肾或肝功能损害患者或儿科或老年患者的疾病状况不仅会影响药物的PK特性，还可能影响安全性和有效性。定义患者的身体和认知限制以及能力也可能影响安全有效地使用某种给药装置的能力。此类障碍可能包括视觉、认知或手部灵活性。通过实现患者方便的自我给药配方，单克隆抗体治疗的高成本也可能阻碍药物在市场上的成功。因此，在评估治疗性单克隆抗体的预期用途时，必须考虑所有这些属性，以便在患者和制造商的需求和限制之间找到平衡。

【NO.3】结论与展望

多年来，治疗性单克隆抗体的成功在一定程度上归功于制造和配方的改进，从而能够开发出更高效、更具成本效益的mAb。制药和生物技术公司利用蛋白质工程技术努力减少mAb异质性，并实施监管机构指南以确保可重复性、安全性和可追溯性。工艺开发的进一步改进包括实施一次性策略，以降低成本并提高平台工艺的灵活性。按照目前的增长速度，基于计算的新型方法将成为工艺开发不可或缺的一部分，并促进翻译后修饰、动力学特性和制剂前筛选等的预测。

在谈论治疗性抗体的预期用途时，重要的是要注意，必须深入考虑几个因素才能做出适当的决定，从选择RoA到药物递送系统和适当的配方，甚至患者群体。调整单克隆抗体的PK/PD特性不仅可以提高安全性和有效性，而且可能有助于提高患者的可接受性和依从性，降低剂量或给药频率，并改善治疗结果。在早期开发中考虑TPP是工艺开发的重要进步，因为RoA、蛋白质修饰和mAb异质性都可能影响治疗性mAb在人类中的行为和安全性。应进行早期配方前实验和评估，以确定哪些辅料是相容的，并研究API稳定性的理想条件，例如温度、pH值等，以改进药品的配方开发。

最终，其目的是最大限度地减少整个过程中的潜在错误和可变性，这些错误和可变性可能会阻碍产品质量并引起安全性或有效性问题。虽然通过高通量技术和低成本替代品的进步，单克隆抗体药物的生产和配方不断取得进展，但仍然存在缺点。与其他药物方式相比，蛋白质药物往往具有更高的商品成本。因此，免疫原性高但生物利用度差的药品的生产成本太高。因此，严格理解和控制过程的每一步是治疗性单克隆抗体成功的基础。

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